Als die Ausgabe von Würmern in pigs

Sign in Hidden fields Patents onshopping.ru onshopping.ru? Genomic research over the past year-tenth has led to an almost complete map of all human genes and opens up new directions in medical research. In dieser Postgeno-mik-Ära sind neue wissenschaftliche Disziplinen entstanden, wie die Proteomik und die funktionelle Genomik. In this Postgeno-mik-era new scientific disciplines have arisen, such as proteomics and functional genomics. Was benötigt wird, sind bessere Screening-Technologien zur Identifikation neuer therapeutischer Ziele sowie bessere Zielvalidierungs-ansätze.

What is needed are better screening technologies to identify new therapeutic targets and better target validation approaches. Mit Ansätzen in allen Disziplinen der modernen Medizin hat die funktionelle Genomik das Potenzial, der Behandlung aller menschlicher Krankheiten ein signifikant neues Gesicht zu verleihen. With approaches in all disciplines of modern medicine functional genomics has the potential to give the treatment of all human diseases a significant стало von Würmern Kätzchen Pyrantel наконец. Pharmaceutical companies are interested in reliable knockdown based technologies since their drug screens with small molecules are based on inhibiting the activity and effect of an expressed protein.

Folglich stellt das Blockieren der Expression oder Funktion eines potenziellen Ziels, entweder mittels Screening in einem zellulären Assay oder durch Einzelgenvalidierung, einen wichtigen Datensatz im Hinblick auf die Arzneistoff-fähigkeit des Ziels zu einem frühen Zeitpunkt im Arzneistoff-Entwicklungsverfahren bereit.

Accordingly, the blocking of the expression or function of a potential target, either through screening in a cellular assay or through Einzelgenvalidierung, an important data set with regard to the drug-ability of the target prepared at an early stage in the drug development process.

Dieser Daten-satz bildet eine starke Grundlage für den Beginn eines Arzneistoff-Entwicklungprogramms auf Basis einer Ver-bindung, eines Antikörpers oder biologisch mit dem Ziel, eine wirksame Therapie zu entwickeln.

This data set provides a strong foundation for the start of a drug-development program based on a Ver binding of an antibody als die Ausgabe von Würmern in pigs biologically with the aim to develop an effective therapy. The study of gene als die Ausgabe von Würmern in pigs in vertebrates is hampered by the complexity of the genome, the multicellular nature and the lack of extensive genetic tools. Die Techniken zur Erzeugung stabiler transgener Zelllinien oder transgener Mäuse sind leistungsfähige, aber sehr zeit- als die Ausgabe von Würmern in pigs arbeitsinten-sive Ansätze, die nicht leicht mit hohem Durchsatz durchgeführt werden können.

The techniques for producing stable transgenic cell lines or transgenic mice are powerful, but very time-consuming and arbeitsinten-intensive approaches that can not be easily performed with high throughput. Antisense, Antikörper, Ribozyme, Aptamere, Zinkfingerproteine, chimäre RNA-DNA-Oligos usw. Various knock-down or knock-out approaches are used to investigate gene function in mammalian cells eg. As antisense, antibodies, ribozymes, aptamers, zinc finger proteins, chimeric RNA-DNA oligos, etc.

Diese Technologien sind jedoch weder robust und leistungsfähig, noch können sie generisch auf alle Gene und alle Zelltypen angewendet werden. However, these technologies are neither robust and powerful, nor click the following article they be applied generically to all genes and all cell types. RNA interference RNAi is the process of post-transcriptional gene silencing that is mediated by double-stranded RNA dsRNA that is homologous in sequence to the disused RNA, and is observed in animals and plants.

In the initial discovery of RNA interference in C. The extracts are now so "programmed" to degrade target RNAs with sequences that overlap the dsRNA fragments. These smaller species are known als die Ausgabe von Würmern in pigs "short interfering" RNAs siRNAs referred. Genetic studies have RNAi associated with the Transposonsilencing als die Ausgabe von Würmern in pigs C.

RNAi, PTGS in plants, embryogenesis in Drosophila, expression and regulation of small RNAs temporary. The Dicer is a member of the RNase III family that is conserved in several species. Die stRNAs werden aus längeren Vorläufer-transkripten prozessiert. The stRNAs are processed from longer precursor transcripts. Die Produkte, die stRNA und die siRNA, haben einige Eigenschaften, die unterschiedlich sind, und einige Eigenschaften, die sie gemeinsam haben. The products that stRNA and siRNA, have some characteristics that are different, and some of the properties that they have in common.

RNAi provides an additional genetic tool to study gene functions for researchers. Der RNAi-Ansatz schafft zusätzliche Möglichkeiten bei Entwicklungsstudien. The RNAi approach creates additional opportunities for development studies. Klassische Knock-outs mit letalen Wirkungen während der Entwicklung könnten niemals in späteren Entwicklungsstadien analysiert werden.

Classical knockouts with lethal effects during development could never be analyzed in later stages of development. Mit RNAi kann das Einsetzen der Wirkung variiert werden, und Rollen in späteren Stadien der Entwicklung können untersucht werden.

With RNAi, the onset of action can be varied and roles in later stages of development may be studied. In mammals, the occurrence of dsRNA in the cell, often generated during viral infections is, to strong cellular responses. Eine hauptsächliche Aktivität wird durch die Interferon-induzierbare dsRNA-abhängige Proteinkinase PKR vermittelt, die an dsRNA bindet.

A major activity is measured by the interferon-inducible dsRNA-dependent protein kinase PKR conveys that binds to dsRNA. Dies führt zur Autophosphorylierung und Aktivierung read more PKR. This results in autophosphorylation and activation of PKR. Infolgedessen führt dsRNA zu einem allgemeinen Translationsblock in Säugerzellen. As a consequence, dsRNA leads to a general translational block in mammalian cells.

Furthermore, in mammals some mRNAs by the nuclear dsRNA-specific adenosine deaminase ADAR be edited. Obwohl ADAR auf bestimmte Substrate, wie mRNAs für Glutamatrezeptoren gluR im Gehirn, selektiv einwirkt, zeigt ihre Aktivität sehr wenig Sequenzspezifität und kann auf jedes dsRNA-Molekül oberhalb einer bestimmten minimalen Länge einwirken.

Although ADAR, selectively applied to certain substrates, such as mRNA for glutamate receptors Glur in the brain, shows their activity very little sequence specificity and can act on any dsRNA molecule above a certain minimum length.

Diese generische modifizierende Aktivität führt zur Desaminierung von Adenosin- zu Inosinresten, was zur Aufwindung der dsRNA-Helix führt. This generic modifying activity results in deamination of adenosine to Inosinresten, leading als die Ausgabe von Würmern in pigs the winding up of the dsRNA helix. In fact failed dsRNA transfection, which functioned in cultured Drosophila cells, wherein various pieces of mammalian cultured cells.

Mikroinjektionsexperimente in Mäuseembryonen und -oozyten zeigten jedoch, dass unter diesen Bedingungen RNAi-Wirkungen beobachtet werden konnten. Microinjection experiments in mouse embryos and -oozyten showed, however, that under these conditions RNAi effects could be observed. Dies legte nahe, dass RNAi in Säuger-Systemen möglich ist. This suggested that RNAi als die Ausgabe von Würmern in pigs mammalian systems is possible.

Recently it has been shown that RNAi can be used in a panel of mammalian cell lines Elbashir et al. Dies umgeht die oben genannten intrazellulären Reaktionen, und führt zu sequenzspezifischem Silencing endogener und heterologer Gene. This circumvents the intracellular responses mentioned above and results in sequence-specific silencing of endogenous and heterologous genes.

An important bottleneck in the siRNA-Transfek-function approach is its limited applicability to the activation of different cell types, especially primary cells. Primärzellen kommen der In-vivo-Situation am nächsten und haben häufig die höchste physiologische Relevanz.

Primary cells are the in vivo situation at the next and often have the highest als die Ausgabe von Würmern in pigs relevance. Transfektionstechnologien für nicht-virale DNA oder siRNA unterliegen schwerwiegenden Beschrän-kungen im Hinblick auf diese Zellen und sind nicht effizient und zuverlässig. Transfection technologies for non-viral DNA or siRNA are serious restric-tions in respect of these cells and are not efficient and reliable.

A practical use of these approaches requires a significant optimization of conditions, and they lack typically at the robustness necessary for large scale applications. Die verwendeten Gentransferreagenzien sind oft toxisch und liefern niedrige Spiegel an lebensfähigen transduzierten Zellen.

The gene transfer reagents used are often toxic and provide low levels of viable transduced cells. In essence, they do not allow a generic siRNA application for a wide variety of als die Ausgabe von Würmern in pigs types, including primary cell types such as T-cells, B-cells, mast cells, endothelial cells, synoviocytes and lung epithelial cells.

Ferner ergibt die Transfektion der siRNA eine kurze Knock-down-Wirkung. Furthermore, transfection of the siRNA gives a short knock-down effect. Für eine länger andauernde Knock-down-Wirkung in Zellen sind mehrere zusätzliche Transfektionen notwendig. For a prolonged knock-down effect in cells several additional transfections are necessary.

Therefore requires bei einem Kind mit Wurm broader application of siRNA technology further research and development in order to overcome these limitations. An implemen-tation of gene knock-down in genomics scale in mammalian cells is prevented by the lack of a reliable, robust and efficient gene transfer technology see abovewhich is applicable in a wide range of cell lines and primary cell types.

The present invention overcomes the recognized by the prior art limitations and finds applications in numerous fields, such as genomics studies, viral production and protein production. The production of recombinant viruses is sometimes complicated by the expression of exogenous sequences that encode lethal or toxic proteins that interfere with virus production.

The prior art discloses als die Ausgabe von Würmern in pigs for the temporary shutdown of protein production, including the tet repressor system and the ecdysone system.

Diese Systeme sind jedoch zeitrau-bend und beinhalten schwierige Klonierungsschritte zum Einbringen der Konstrukte in die Vektoren. However, these systems are zeitrau-bend and involve difficult cloning steps to introduce the constructs into the vectors. Ein weiterer Nachteil der Repressorsysteme des Standes der Technik ist, dass man zur Expression des exogenen Gens oft eine Verbindung hinzugeben muss, die das Suppressorsystem selbst supprimiert, um die Genexpression einzuschalten.

Another disadvantage of the repressor of the prior art is that it is necessary for the expression of als die Ausgabe von Würmern in pigs exogenous gene often add a compound that suppresses the suppressor system itself to turn on gene expression. Die vorliegende Erfindung kann auf jedes Virusver-packungs- und Proteinproduktionssystem angewendet werden, um die Produktion durch selektiven Knock-down letaler oder rekombinanter Proteine während der Virus- bzw. The present invention can be applied to any Virusver-packaging and protein production system to improve production by the selective knock-down of lethal or recombinant proteins during the viral or producing cell production phases.

Another embodiment of the invention relates to such vectors containing a selbstkomplementierendes Einzelstrangpolynukleotid, wherein the second nucleotide sequence comprises a stem-loop-forming region with a sequence which is derived from naturally occurring RNA sequences found in RNA molecules, and no specific RNA molecule in a host cell functionally addressed. Am stärksten bevorzugt sind die zweiten Sequenzen von anderen RNA-Molekülen als mRNA abgeleitet.

Most preferably the second sequences from als die Ausgabe von Würmern in pigs RNA molecules are derived as mRNA. Relates to another aspect of the present invention, an in vitro method for reducing the amount of at least one present in a host cell RNA molecule having a unique sequence, wherein said cell is transfected with a vector according to als die Ausgabe von Würmern in pigs invention, wherein the Polynukleo-tid a first sequence includes, which is complementary to the RNA sequence.

Another aspect of the present invention relates to a method for producing a vector according to the invention, which contains the sequence of a polynucleotide, wherein the selbstkomplementie-Governing polynucleotide is a DNA sequence and further comprises a fourth sequence linked to the free end the first sequence is bound, and wherein said polynucleotide is denatured, converted into a double-stranded polynucleotide will be and will be in a vector capable of transfecting a host cell and transcription of the polynucleotide, ligated.

Another aspect of the present invention relates to a method for determining the function of a naturally occurring polynucleotide sequence, wherein the transfecting a host cell with a vector according to the invention, wherein the vector is a Polynukleo-tidsequenz which is complementary to the poly-nucleotide naturally occurring includes, and you can prove a change in cell phenotype.

Further aspects of the invention relate to Biblio-libraries of vectors of the invention. Die hier nachstehend beschriebenen Als die Ausgabe von Würmern in pigs werden in jede ausgewählte Verpackungszelle transfi-ziert, und diese transfizierten Zellen werden direkt verwendet. The hereinafter described knock-down constructs are in each selected packaging cell transfi-ed, and these transfected cells are used directly.

Das Knock-down-System verwendet Viruskon-strukte, die direkt zur Infektion von Zellen verwendet werden, und keine weitere Verbindung als die Ausgabe von Würmern in pigs von dem Verfahren zur Induktion der Virus- oder Proteinpro-duktion benötigt.

The knock-down system uses Viruskon-constructs that are used directly to infect cells and no further compound is required by the method of inducing virus or Proteinpro-production. The products of these two separate PCR reactions are used as template for a final PCR reaction. Die Infektion mit dem Adenovirus hatte keine Wirkung auf die Knock-down-Aktivität, die durch die transient transfizierten Plasmide erhalten wurde, unter den in diesem Beispiel verwendeten Bedingungen.

The infection with the adenovirus had no effect on the als die Ausgabe von Würmern in pigs activity obtained by the transiently transfected plasmids under the als die Ausgabe von Würmern in pigs used in this example. Die Ergebnisse zeigen, dass der Knock-down-Effekt von der MOI abhängt. The results show that the knock-down effect is dependent on the MOI.

C show the successful knock-down of endogenous mRNA by adenoviral several knock-down constructs as measured by real-time PCR. Der Knock-down-Effekt hängt von der MOI und von der Zeit ab. The knock-down effect is dependent on the MOI and time of. Adenoviruskonstrukte, die gegen GNAS gerichtete sRNA codieren, ergeben einen spezifischen Knock-down von GNAS als die Ausgabe von Würmern in pigs funktioneller Ebene.

Adenoviral constructs encoding sRNA against GNAS directed, give a specific knock-down of Gnas on a functional level. The following definitions are used in the description and in the examples to aid in understanding the scope of the present invention. Weitere spezifische Beispiele für toxische Proteine sind Tiam, Rac, Rho und Ras in als die Ausgabe von Würmern in pigs Länge.

More specific examples of toxic proteins are Als die Ausgabe von Würmern in pigs, Rac, Rho and Ras in full length. Die wissenschaftliche Literatur beschreibt, dass siRNA den sequenzspezifischen Abbau einer Ziel-mRNA vermittelt. The scientific literature describes siRNA mediated the Она Kürbiskernen Rezept Kinder für Würmer они degradation of a target mRNA. Die komplementierenden Basenpaare, die den Stammteil der Schleife bilden, bestehen aus mindestens zwei und stärker bevorzugt mindestens drei Basenpaaren in der Länge.

The complementing base pairs that form the stem portion of the loop, consisting of at least two and more preferably at least three base pairs in length. Unter diesen speziellen Umständen wird der Stammteil der zweiten Sequenz derart betrachtet, dass er nur ein komplemen-tierendes Basenpaar oder keine komplementierenden Basenpaare enthält.

Under these special circumstances the stem portion of the second sequence is considered such that it contains only a complementation-tier end base pair, or no complementing base pairs. Es beinhaltet, ist aber nicht beschränkt auf Transduktion z. Virenvektoren, Pagen, Elektroporation, über ein Tränkverfahren, oder Einbringen der Nukleinsäure unter Verwendung eines physikalischen Verfahrens, wie Mikroinjektion oder Beschuss mit DNA-beschichteten Teilchen.

It includes, but is not als die Ausgabe von Würmern in pigs to transduction, for. Example, by calcium phosphate or reagents based on liposomes, infection by z. Virus vectors, pages, electroporation, via a soaking process, or introduction of the nucleic acid using a physical method such as microinjection or bombardment with DNA-coated particles. The self-complementing single-strangpolynukleotid contained in a vector of the invention comprises a first guide sequence and a second sequence capable of forming a stem-loop structure within the second sequence, when it comes to RNA in the second sequence, a third sequence encoding the first guide sequence complements and is covalently linked to the distal end of the second sequence, wherein all nucleotides can base pair in the first als die Ausgabe von Würmern in pigs third sequence.

Die bevorzugten selbstkomplementie-renden Polynukleotide umfassen eine zweite Nukleotid-sequenz, die eine Stamm-Schleife-bildende Region umfasst, die von anderen Als die Ausgabe von Würmern in pigs als mRNA abgeleitet ist. The preferred selbstkomplementie-Governing polynucleotides comprise a second nucleotide sequence comprising a stem-loop forming region that is derived from other RNA molecules as mRNA.

The present invention provides that the first sequence is a leader sequence, which brings about a control of the stRNA, siRNA, sRNAoder or chimeric RNA encoded by the single stranded polynucleotide of the vector to an mRNA with a complementary sequence in the host cell system.

Die RNA in der Wirtszelle ist eine mRNA. The RNA in the host cell is a mRNA. Die mRNA in der Wirtszelle kann eine bekannte mRNA sein, die für ein Protein bekannter Funktion codiert, oder es kann unbekannt sein, ob sie mit irgendeinem bestimmten Protein oder einer bestimmten zellulären Funktion in Zusammenhang steht.

The mRNA in the host cell may be a known mRNA that encodes a protein of known function, or it may be known whether it is with any particular protein or a particular cellular function in the context. Preferred stem-loop sequences are based on stem-loop regions, of which the skilled worker is aware that they occur in RNA molecules such as tRNA, snRNA, rRNA, mtRNA- or structural RNA sequences.

Ein Fachmann kann Stamm-Schleife-RNA-Strukturen leicht unter Verwendung prädiktiver Computermodel-lierungsprogramme identifizieren, wie Mfold M. A skilled artisan can stem-loop RNA als die Ausgabe von Würmern in pigs easily identify using predictive computer model lierungsprogramme how Mfold M.

Gorodkin, LJ Als die Ausgabe von Würmern in pigs und GD Stormo. Nucleic Acids Research, Bd. RNA stem-loop structures are also found in databases such as the database for small RNA Karthika Perumal, Jian Gu, Yahua Chen and Ram Reddy, Department of Pharmacology, Baylor College of Medicine, USAthe database for non-coding RNAs Erdman VA, Barciszewska MZ, Szymanski M, Hochberg A.

Using these programs, one can identify an RNA stem-loop sequence which can then be modified to remove multiple loop regions so that a shorter, more easily synthesized stem-loop sequence is obtained. Durch Beseitigen der mehrfachen Schleifensegmente aus diesen Sequenzen, die durch die vorstehend genannten Computerprogramme vorausgesagt werden, werden Stamm-Schleifen-Sequenzen hergestellt, die leichter zu synthetisieren und handzuhaben sind.

By eliminating the multiple loop segments of these sequences that are predicted by the computer programs above, stem-loop sequences are prepared, which are easier to synthesize and to handle.

The fourth nucleotide sequence can preferably be derived from RNA precursors such as ribozymes, tRNA precursor rRNA precursor microRNA precursors, recognized by ribozymes or RNAs recognized by RNase P RNAs. In der Wirtszelle vorhandene Enzyme prozessieren RNA-Vorläufer. In the host cell enzymes present litigate RNA precursor.

Diese vierten Nukleotidsequenzen sind vorzugsweise derart gestaltet, dass sie durch Enzyme gespalten werden, die in der Wirtszelle vorhanden sind. This fourth nucleotide sequences are preferably designed such that they are cleaved by enzymes that are present in the host cell. The aforesaid fourth sequences may also be derived from "overhang" sequences that are found naturally, such as sequences that extend beyond the complementing portion of RNAs in the "microRNA" family addition.

Diese RNA-Vorläufer mit Haarnadel-Struktur können auch in einem Cluster aus mehreren Vorläufern vorliegen. These RNA precursor hairpin structure may also be in a cluster of several precursors. Beispiele für identifizierte miRNAs sind in Lagos-Quintana, M et al. Examples of identified miRNAs are in Lagos-Quintana, M et al.

A most preferred dsDNA polynucleotide comprises a fourth sequence whose function is that it allows an oriented cloning into a DNA vector according to the invention, as described below in more detail.

Die dsDNA-Polynukleotidsequenzen können Restriktionsstellen an jedem Ende enthalten, die für eine Spaltung durch ein Restriktionsenzym oder zwei verschiedene Restriktionsenzyme empfänglich sind, so dass effizientes Klonieren möglich ist. Als die Ausgabe von Würmern in pigs dsDNA polynucleotide sequences may contain restriction sites at either end that are susceptible for cleavage by one restriction enzyme or two different restriction enzymes so that efficient cloning is possible.

Das dsDNA-Polynukleotid, das die spaltbaren Restriktionsstellen an den Termini enthält, kann durch molekularbiologische Standard-techniken erzeugt werden, zum Beispiel durch Hybridisierung zweier komplementärer ssDNA-Oligo-nukleotide. The dsDNA polynucleotide containing the cleavable restriction sites at the termini can be generated by standard molecular biological techniques, for example by hybridization of als die Ausgabe von Würmern in pigs complementary ssDNA oligo-nucleotides.

Furthermore, the skilled artisan can use for cloning blunt ends and PCR to develop alternative synthetic routes to obtain and described herein oriented cloning. The aforesaid fourth als die Ausgabe von Würmern in pigs fifth sequences may be transcribed from the DNA sequence or not, which is present in a DNA vector of the invention, but can exert a function as a part of the upstream promoter or downstream termination signal of the current.

Consequently, the fourth sequence containing the start signal for the transcription by RNA polymerase, and the fifth sequence comprise a stop signal, such as a sequence of a plurality of "T" which is transcribed into a fifth RNA sequence with a plurality of "U" -Nukleotiden. After transcription the fourth sequence may be with the exception of one to about five, more preferably one to about three "G" -Nukleotiden not be transcribed into RNA.

The self-complementing Einzelstrangpolynukleotide can be synthesized by chemical synthesis. Das isolierte synthetische Polynukleotid kann zur Herstellung eines Vektors für die Verwendung als Zwischenprodukt bei der Ausführung der please click for source Erfindung verwendet oder weiter verlängert werden, so dass es die komplementierende dritte Sequenz enthält.

The isolated synthetic polynucleotide may be used for the preparation of a vector for use as an intermediate in the embodiment of the present invention, or further lengthened so that it contains the complementing third sequence. In practice about two to about five sequences are chosen from a single RNA sequence for the zur stehenden Mitteln gegen of a corresponding number of vectors containing the self-complementing polynucleotides.

The present process, which will be described in greater detail, using these "redundant" set of vectors containing the selbstkomplementie-Governing single polynucleotides to determine the optimum choice of RNA sequence that addresses only one unique RNA that of a family RNA with homologous sequence regions can be present.

Alternativ kann eine Sequenz gestaltet werden, die gegen mehrere RNA-Ziele gerichtet ist, wenn ein Knock-down von mehr als einem RNA-Ziel, z. Alternatively, a sequence can be created that is directed against multiple RNA targets when a knock-down of more als die Ausgabe von Würmern in pigs one RNA target, z. RNAs belonging to a family, is desired. The polynucleotide, which has been produced as a result of the extension reaction using the template or by chemical als die Ausgabe von Würmern in pigs comprises a first nucleotide sequence and a third nucleotide sequence covalently linked by a second nucleotide sequence which is capable of forming a stem-loop structure, connected are such that all of the nucleotides are capable of each other in the first sequence and the third sequence of base-pairing.

Die zu der ersten Sequenz komplementäre dritte Sequenz ist mit dem distalen Ende der zweiten Sequenz kovalent verbunden. The complementary to the first sequence third sequence is covalently linked to the distal end of the second sequence. In a particular embodiment of the intermediate polynucleotide of the vectors of the present invention, the second nucleotide sequence contains at least a nucleotide sequence which is capable of being cleaved enzymatically.

Eine stärker bevorzugte Ausführungsform umfasst eine zweite Sequenz, die mindestens zwei enzymatische Spaltstellen aufweist. A more preferred embodiment comprises a second sequence comprising at least two enzymatic cleavage sites.

A Haben Würmer übertragen durch Küssen preferred intermediate poly-nucleotide comprises a second polynucleotide sequence including the establishment of encoding the stem portion of the stem-loop structure at least one of the enzymatic cleavage sites. Enzymatische Spaltstellen bestehen aus Nukleotidsequenzen, die mindestens vier bis etwa acht Basenpaare enthalten und sind dem Fachmann bekannt.

Enzymatic cleavage sites consist of nucleotide sequences containing at least four to about eight base pairs and are known in the art. The present invention relates to vector constructs comprising the self-complementing the Polynukleo TID and a pol III promoter sequence which is located upstream of the first sequence of the polynucleotide.

The inventive self-complementing DNA polynucleotide may preferably be inserted into a plasmid DNA vector, a viral adenovirus DNA vector, adeno-associated virus vector a or a herpes vector. Der DNA-Plasmidvektor kann allein oder mit verschiedenen Vehikeln komplexiert zugeführt werden. The DNA plasmid may be supplied alone or complexed with various vehicles. Preferably, recombinant vectors capable of expressing the polynucleotides according to the invention, locally delivered as described below, and persist in target cells.

Nachdem es exprimiert wurde, wird das selbstkomplementierende RNA-Molekül prozessiert und zur als die Ausgabe von Würmern in pigs Ziel-RNA geführt, an der es die Funktion des Abbaus der Ziel-RNA ausübt. After it was expressed, the self-complementing RNA molecule is processed and is guided to the endogenous target RNA, where it performs the function of the degradation of the target RNA. The promoter sequences are the Pol III promoters.

In vector construction, the polynucleotides of the invention can be additionally connected to the promoter, with one or more regulatory regions. Die Auswahl der geeigneten regulatorischen Region oder Regionen ist eine Routineangelegenheit innerhalb der gewöhnlichen Fähigkeiten des Fachmanns.

Selection of the continue reading regulatory region or regions is a routine matter within the ordinary skill of the art. Andere regulatorische Regionen als Promotoren sind ua Enhancer, Suppressoren usw. Other regulatory regions as promoters include enhancers, suppressors, etc. In addition to recombinant adenovirus dsDNAsystems, other viral packaging systems such as ssDNA viruses, for example adenovirusassoziiertes virus AAVsuitable for the use as vector backbone in the present invention.

In addition, other dsDNA viruses, such as Epstein-Barr virus, herpes simplex virus, baculovirus or vaccinia viruses, can be als die Ausgabe von Würmern in pigs as vector backbone constructs in the present invention.

Jedes dieser Systeme hat ein als die Ausgabe von Würmern in pigs Wirtsspektrum. Each of these systems has a different host range. For expression in AAV, the polynucleotide is cloned into an AAV expression vector.

Nach der Entwicklung der maximalen Zytopathologie wird der Überstand geerntet und, wenn notwendig, eingeengt Halbert et al. For vaccinia virus expression, a replication competent vaccinia virus can be used. Folglich kann das Polynukleotid in den Ziel-Säugerwirtszellen exprimiert werden, ohne dass sich die она Würmer in der Vagina bei Mädchen извлек Vacciniavirus induzierte Zytopathologie entwickelt.

Thus, the polynucleotide can be expressed in the target mammalian host cells, without the development of vaccinia virus induced cytopathology.

Das Konstrukt wird durch homologe Rekombination in das Vaccinia-Genom inseriert. The construct als die Ausgabe von Würmern in pigs inserted by homologous recombination into the vaccinia genome.

Rekombinante Viren können durch In-situ-Färbung hinsichtlich der beta-Galactosidase-Expression mit X-Gal Wyatt et al. Additional vector systems include the non-viral systems that facilitate introduction of DNA encoding the self-complementing single-stranded RNA for, or the RNA itself als die Ausgabe von Würmern in pigs a patient.

Zum Beispiel kann ein DNA-Vektor, der eine gewünschte Sequenz codiert, mittels Lipofektion in vivo eingebracht werden. For example, a DNA vector encoding a desired sequence can be introduced by lipofection in vivo. Synthetische kationische Lipide, die derart gestaltet sind, dass sie die Schwierigkeiten begrenzen, auf die man bei der Liposomen-vermittelten Transfektion trifft, können zur Herstellung von Liposomen für die In-vivo-Transfektion eines Gens verwendet werden, das einen Marker codiert Felgner et al.

Die Verwendung von Lipofektion zum Einbringen exogener Gene in die spezifischen Organe in vivo hat bestimmte praktische Vorteile, und das Steuern der Transfektion zu bestimmten Zelltypen wäre in einem Gewebe mit zellulärer Heterogenität, zum Beispiel Pankreas, Leber, Niere und Gehirn, besonders vorteil-haft.

The use of lipofection to introduce exogenous genes into the specific organs in vivo has certain practical advantages, and controlling the transfection to particular cell types would be in a tissue with cellular heterogeneity, such as pancreas, liver, kidney and brain, particularly advantageous-adhesive. Lipide können zu Zielsteuerungszwecken mit anderen Molekülen chemisch gekoppelt werden. Lipids may be chemically coupled to targeting purposes with other molecules.

Hormone oder Neurotransmitter und Proteine, zum Beispiel Antikörper, oder Nicht-Peptid-Moleküle können mit Liposomen chemisch gekoppelt werden. Andere Moleküle sind ebenfalls zur Erleich-terung der Transfektion einer Nukleinsäure in vivo geeignet, zum Beispiel ein kationisches Oligopeptid z.

Vektoren können auch aus anderen Adenovirus-Serotypen und entsprechenden Verpackungszellen, die Sequenzen für die viralen Proteine enthalten, die aus diesen Vektorgrundgerüsten deletiert wurden, hergestellt werden. Vectors may also be prepared from other adenovirus serotypes and corresponding packaging cells that include sequences for viral proteins deleted from such vector backbones. The vectors of the invention, as described herein, are also useful in methods of lowering the amounts of RNA or protein which is transcribed from the RNA, suitable in a host cell or a subject, wherein the cell or individual with a vector of the invention transfected.

Preferred vectors of the invention comprise the above-mentioned first nucleotide sequence and a third nucleotide sequence by a second nucleotide sequence which is capable of forming a stem-loop structure that is covalently linked such that all nucleotides in said first sequence and said third sequences for base pairing with each other capable, and wherein the second nucleotide sequence comprises a stem-loop-forming region, which is derived from naturally occurring RNA sequences that are found in other RNA molecules as mRNA, such as tRNA, snRNA, rRNA - mtRNA- or structural RNA sequences.

Die Verabreichung des vorstehend genannten Vektors an ein Individuum umfasst die Verabreichung einer Menge an Vektor, die bewirkt, dass die Mengen der RNA in den transfizierten Zellen des Individuums gesenkt werden. The administration of the aforesaid vector to a subject comprises the administration of an amount of vector, which causes the amounts of RNA can be reduced in the transfected cells of the individual.

The preferred vector of the invention containing a polynucleotide comprising a promoter that is operatively linked to a sequence of a self-complementing polynucleotide, may be prepared by denaturing the self-complementing polynucleotide, converting the denatured polynucleotide resulting in a double-stranded polynucleotide, and the double-stranded polynucleotide ligated into a vector which is able to transcribe a host cell to transfect and the polynucleotide.

Alternativ kann das selbstkomplemen-tierende Polynukleotid als zwei einzelsträngige Polynukleotide chemisch synthetisiert werden, die zur Hybridisierung miteinander fähig sind, gefolgt von Ligation in den Vektor.

Alternatively, the selbstkomplemen-tier border polynucleotide as two single-stranded polynucleotides may be chemically synthesized, which are capable of hybridizing with each other, followed by ligation into the vector. Die Ligation kann vorzugsweise in ein Adapterplasmid erfolgen, das durch Co-Transfektion mit einem Helfermolekül zur Bildung eines transfizierbaren Virusvektorpartikels in einer Verpackungszelllinie verwendet werden kann.

The ligation can take place preferably in an adapter plasmid that can be used by co-transfection with a helper molecule to form a transfectable viral vector particle in a packaging cell line.

A further embodiment of the vector construct encoding the self-complementing polynucleotide that is that wherein the second nucleotide sequence contains at least a nucleotide sequence which is capable of being cleaved enzymatically. Eine stärker bevorzugte Ausführungsform umfasst eine zweite Sequenz, die mindestens zwei enzymatische Spaltstellen hat.

A more preferred embodiment comprises a second sequence which has at least two enzymatic cleavage sites. Bei dieser Ausführungsform kann die zweite Sequenz, die jede beliebige Länge haben kann, durch enzymatische Spaltung entfernt und durch eine Stamm-Schleife-Sequenz ersetzt werden.

In this embodiment, the second sequence may be of any length, can be removed by enzymatic cleavage and replaced by a stem-loop sequence.

Bei einer weiteren Ausführungsform codiert die zweite Nukleotidsequenz für ein Gen, das sich zur Erleichterung der Klonierung von Stamm-Schleife-Sequenzen in den Vektor eignet. In another embodiment, the second nucleotide sequence encoding a gene that is to facilitate the cloning of stem-loop sequences into the vector. Bei einer weiteren speziellen Ausführungsform ist das Gen, das zur Erleichterung der Klonierung von Stamm-Schleife-Sequenzen in den Vektor geeignet ist, das E.

In another particular embodiment, the gene, which is suitable to facilitate the cloning stem-loop sequences into the vector, the E. The vectors of the invention can be administered to a patient by a variety of methods. Sie können direkt zu Zielgeweben gegeben werden, mit kationischen Lipiden komplexiert, in Liposomen verpackt oder den Zielzellen durch andere, im Stand der Technik bekannte Verfahren zugeführt werden. They can be added directly to target tissues, complexed with cationic lipids, are the target cells supplied by others, known in the prior art methods packaged in liposomes or.

Eine lokalisierte Verabreichung an die gewünschten Gewebe kann mittels Katheter, Infusionspumpe oder Stent, mit oder ohne Einbringen des selbstkomplemen-tierenden Polynukleotids in Biopolymere, erfolgen. Localized administration to the desired tissues may means of a catheter, infusion pump or stent, with or without introducing the selbstkomplemen-tier forming polynucleotide in biopolymers. Preferably, the Virusvek-gates, which are used in gene therapy methods of the present disclosure, replication defective.

Diesen replikationsdefektiven Vektoren fehlt gewöhnlich mindestens eine Region, die zur Replikation des Virus in der infizierten Zelle notwendig ist.

This replication-defective vectors usually lack at least one region that is necessary for replication of the virus in the infected cell.

Diese Regionen können entweder ganz oder teilweise beseitigt oder durch jede Technik, die einen Fachmann bekannt ist, nicht-funktionell gemacht werden. These regions can either be fully or partially eliminated or made by any technique known to those skilled, non-functional. Diese Techniken beinhalten die vollständige Entfernung, Substitution, teilweise Deletion oder Hinzufügung von einer oder mehreren Basen in einer für die Replikation wesentlichen Region.

These techniques include the total removal, substitution, partial deletion or addition of one or more bases in a substantial for replication region. Derartige Techniken können in vitro an der isolierten DNA oder in situ unter Verwendung der Techniken zur genetischen Manipulation oder durch Behandlung mit mutagenen Mitteln erhalten werden. Such techniques can be obtained in vitro on the isolated DNA or in situ, using the techniques of genetic manipulation or by treatment with mutagenic agents.

Vorzugsweise behält das replikationsdefektive Virus die Sequenzen seines Genoms bei, die zur Einkapselung der Viruspartikel notwendig sind. Preferably, the replication defective virus retains the sequences of its genome which are necessary for encapsulating the viral particles.

In other embodiments of the present invention are adeno-associated viruses "AAV" used. The AAV virus is relatively small DNA viruses which integrate stably and site-specific manner into the genome of infected cells. Sie sind zur Infektion eines breiten Spektrums an Zellen fähig, ohne irgendeine Wirkung auf das Wachstum, die Morphologie oder die Differenzierung der Zellen zu verursachen, und sie scheinen nicht an Pathologien beim Menschen beteiligt zu sein.

They are able to cause the growth, morphology or differentiation of the cells without any effect on the infection of a broad spectrum of cells, and they do not seem to be involved in pathologies in humans.

Nackte DNA-Vektoren für die Gentherapie können in die gewünschten Wirtszellen durch im Stand der Technik bekannte Verfahren eingebracht werden, z. Transfek-tion, Elektroporation, Mikroinjektion, Transduktion, Zellfusion, DEAE-Dextran, Calciumphosphat-Fällung, Verwendung eines Gen-Gewehrs oder Verwendung eines DNA-Vektor-Transporters siehe z.

Naked DNA vectors for gene therapy can be introduced into the desired host cells by methods known in go here art, als die Ausgabe von Würmern in pigs. Transfek-tion, electroporation, microinjection, transduction, cell fusion, DEAE dextran, calcium phosphate precipitation, use of a gene gun or use of a DNA vector transporter see, e.

Rezeptorvermittelte DNA-Zufuhransätze können ebenfalls verwendet werden Curiel et al. The present invention relates in a particular embodiment a composition comprising a vector of the invention comprises a polynucleotide selbstkomplementierendes, http://onshopping.ru/blog/wie-wuermer-bei-erwachsenen-zu-erkennen.php is used to down regulate or block the expression of specific polypeptides or specific non-coding RNA molecules.

Die Nukleinsäure codiert ein selbstkomplementierendes sRNA-Molekül, das durch eine Stamm-Schleife-RNA-Sequenz kovalent verbunden ist. The nucleic acid encoding a selbstkomplementierendes sRNA molecule covalently linked by a stem-loop RNA sequence. Bei dieser Ausführungsform ist die Nukleinsäure mit Signalen operativ verbunden, welche die Expression der Nukleotidsequenz ermöglichen, und wird in eine Zelle unter Verwendung rekombinanter Vektorkon-strukte eingebracht, welche die Polynukleinsäure exprimieren, nachdem der Vektor in die Zelle eingebracht worden ist.

In this embodiment, the nucleic acid is operatively associated with signals als die Ausgabe von Würmern in pigs allow the expression of the nucleotide sequence, and is introduced als die Ausgabe von Würmern in pigs a cell using recombinant Vektorkon-constructs which express the polynucleic acid once the vector has been introduced into the cell.

Beispiele für geeignete Vektoren sind ua Plasmide, Adenoviren, adenoassoziierte Viren, Retroviren und Herpesviren. Examples of suitable vectors include plasmids, von für Hühner bedeutet, Würmern, adeno-associated viruses, als die Ausgabe von Würmern in pigs and herpesviruses.

The present invention provides biologically compatible compositions comprising vectors according to the invention. A biologically compatible composition is a composition, the solid, liquid, be a gel or may have another form in which the vector of the invention is maintained in an als die Ausgabe von Würmern in pigs form, eg.

As in a form which is capable of a biological activity to effect. Zum Beispiel ist ein Vektor fähig, eine Zielzelle zu transfizieren. For example, a vector is able to transfect a target cell. Eine bevorzugte biologisch verträgliche Zusammensetzung ist eine wässrige Lösung, die unter Verwendung von z.

Tris- Phosphat- oder HEPES-Puffer, die Just click for source enthalten, gepuffert ist. A preferred biologically compatible composition is an aqueous solution that is using, for.

Example, Tris, phosphate, or HEPES buffer, containing salt ions, buffered. Gewöhnlich ist die Konzentration an Salzionen ähnlich wie physiologische Spiegel. Usually the concentration of salt ions is similar to physiological levels. Biologisch verträgliche Lösungen können Stabilisierungs- und Konservierungsmittel enthalten.

Biologically compatible solutions may include stabilizing agents and preservatives. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die biokompatible Zusammensetzung eine pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzung. In a more preferred embodiment, the biocompatible composition is a pharmaceutically acceptable composition. These compositions may be formulated in a topical, oral, parenteral, intranasal, subcutaneous, and intraocular route of administration. Parenterale Verabreichung soll bedeuten, dass sie intravenöse Injektion, intramuskuläre Injektion und intraarterielle Injektions- oder Infusionstechniken beinhaltet.

Parenteral administration should mean that it involves intravenous als die Ausgabe von Würmern in pigs, intramuscular injection and intra-arterial injection or infusion techniques. Die Zusammensetzung kann parenteral in Dosierungseinheitsformulierungen verabreicht werden, die bekannte nicht-toxische, physiologisch annehmbare Standardträger, Hilfsstoffe und Vehikel, wie gewünscht, enthalten.

The composition may be administered parenterally in dosage unit formulations containing, as desired, contain well-known, non-toxic, physiologically acceptable standard carriers, adjuvants and vehicles. Pharmaceutical compositions for oral administration may be formulated in form suitable for oral administration, dosages in the art using known pharmaceutically acceptable carriers. These carriers enable the pharmaceutical compositions to be formulated as tablets, pills, dragees, capsules, liquids, gels, syrups, slurries, suspensions and the like, als die Ausgabe von Würmern in pigs ingestion by the patient to be formulated.

Pharmazeutische Zusammensetzungen zur oralen Verwendung können durch Kombination von Wirkstoffen mit einem festen Excipienten, gegebenenfalls Mahlen des erhaltenen Gemischs und Verarbeiten des Gemischs von Granulaten nach Zugabe geeigneter Hilfsstoffe, wenn gewünscht, zu Tabletten oder Drageekernen hergestellt werden.

Pharmaceutical compositions for oral use can be prepared by combining active compounds with solid excipients, als die Ausgabe von Würmern in pigs grinding the resulting mixture and processing the mixture of granules after adding suitable auxiliaries, if desired, be made into tablets or als die Ausgabe von Würmern in pigs cores.

Wenn gewünscht, können Auflöse- oder Solubilisierungsmittel, wie das vernetzte Polyvinylpyrrolidon, Agar, Alginsäure oder ein Salz davon, wie Natriumalginat, hinzugefügt werden.

If desired, pulping or solubilizing agent such as the cross-linked polyvinyl pyrrolidone, agar, alginic acid or a salt thereof such as sodium alginate, are added.

Farbstoffe oder Pigmente können zu den Tabletten oder Dragee-Überzügen zur Produktkenn-zeichnung oder, um die Menge an Wirkstoff, dh die Dosierung, zu kennzeichnen, hinzugefügt werden. Dyes or pigments can to the tablets or dragee als die Ausgabe von Würmern in pigs for product identification or drawing to be added to als die Ausgabe von Würmern in pigs amount of active ingredient, ie, the dosage to identify.

Pharmaceutical preparations which can be used orally include push-fit capsules made of gelatin as well as soft, sealed capsules made of gelatin and a coating such as glycerol or sorbitol. Push-fit-Kapseln können Wirkstoffe im Gemisch mit Füllstoff oder Bindemitteln, wie Lactose oder Stärken, Gleitmittel, wie Talk oder Magnesiumstearat, und gegebenenfalls Stabilisatoren enthalten. Push-fit capsules can contain active ingredients mixed with filler or binders such as lactose or starches, lubricants, such as talc or magnesium stearate and, optionally, stabilizers.

In weichen Kapseln können die Wirkstoffe in geeigneten Flüssigkeiten, wie Fettölen, Flüssigkeit oder flüssigem Polyethylenglykol mit oder ohne Stabilisatoren gelöst oder suspendiert werden. In soft capsules, the active compounds can be dissolved or suspended with or without stabilizers in suitable liquids, such as fatty oils, liquid, or liquid polyethylene glycol.

Preferred sterile injectable preparations can be a solution or a suspension in a nontoxic parenterally acceptable solvent or diluent. Beispiele für pharmazeutisch annehmbare Träger sind Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, isotonische Kochsalzlösung z.

Mononatrium- oder Dinatriumphosphat, Natrium- Kalium- Calcium- oder Magnesiumchlorid oder Gemische solcher SalzeRinger-Lösung, Dextrose, Wasser, steriles Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen davon. Examples of pharmaceutically acceptable carriers are saline, buffered saline, isotonic saline z.

Any bland fixed oil, including synthetic mono- or diglycerides can also be als die Ausgabe von Würmern in pigs. Fettsäuren, wie Ölsäure, finden ebenfalls Verwendung bei der Als die Ausgabe von Würmern in pigs injizierbarer Zubereitungen. Fatty acids such as oleic acid also find use in the preparation of injectable preparations.

The composition medium can also be a hydrogel which is prepared from a biocompatible or non-cytotoxic homo- or hetero-polymer, such as a polyacrylic acid polymer hydrophilic, which can serve as a drug absorbing sponge. Ein Hydrogel kann direkt auf die Oberfläche des zu behandelnden Gewebes, zum Beispiel während eines chirurgischen Eingriffs, aufgebracht werden.

A hydrogel can be directly applied to the surface of the tissue to be treated, for example during a surgical procedure. Preferred inventive pharmaceutical compositions comprise a replication-defective recombinant viral vector and identified by the present invention polynucleotide. A specific embodiment of the composition according to the invention also contains a transfection enhancer such as poloxamer. Ein mit rekombinanten Viren imprägniertes Poloxamer kann direkt als die Ausgabe von Würmern in pigs die Oberfläche des zu behandelnden Gewebes, zum Beispiel während eines chirurgischen Eingriffs, aufgebracht werden.

An impregnated with recombinant viruses poloxamer can be directly applied to the surface of the tissue to be treated, for example during a surgical procedure. Poloxamer besitzt im Wesentlichen die gleichen Vorteile wie Hydrogel, hat aber eine niedrigere Viskosität.

Poloxamer possesses essentially the same advantages as hydrogel, but has a lower viscosity. The formulation of the invention may, as needed for the particular indication being treated, also contain more than one active agent, preferably those with als die Ausgabe von Würmern in pigs activities that do not adversely affect each other themselves.

Alternativ oder zusätzlich kann die Zusammensetzung ein zytotoxisches Mittel, Cytokin oder ein wachstumshemmendes Mittel umfassen. Alternatively or additionally, the composition may comprise a cytotoxic agent, cytokine or growth inhibitory agent.

Solche Moleküle liegen in Kombination geeigneterweise in Mengen vor, die für den beabsichtigten Zweck wirksam sind. Such molecules are combined suitably in amounts that are effective for the intended purpose. Die Formulierungen, die zur Als die Ausgabe von Würmern in pigs verwendet werden sollen, müssen steril Diät Würmer Kindern eine bei. The formulations to be used for in vivo administration must be sterile.

Dies wird leicht mittels Filtration durch sterile Filtrations-membranen erzielt. This is readily accomplished by filtration through sterile http://onshopping.ru/blog/einige-wuermer-verursachen-hautausschlag.php membranes.

Poly methylmethacrylat -Mikrokapseln, in kolloidalen Arzneistoffzufuhrsystemen zum Beispiel Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanopartikel und Nanokapseln oder in Makroemulsionen eingefangen werden. The active compounds according to the invention here also be in micro-capsules, which are prepared, for example, by interfacial polymerization, for example hydroxymethylcellulose or gelatin-microcapsules and poly methylmethacylate microcapsules, in colloidal drug delivery systems for example liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles and nanocapsules be captured or in macroemulsions.

Sustained-release preparations may be prepared. Geeignete Beispiele für Zuberei-tungen mit verzögerter Freisetzung sind ua semipermeable Matrizen aus festen hydrophoben Polymeren, die den Antikörper enthalten, wobei die Matrizen die Form von geformten Gegenständen, z.

Filmen oder Mikrokapseln, haben. Suitable examples of Preparations of sustained release include semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers containing the antibody, which matrices are in the form of shaped articles, eg. As films or microcapsules. The present disclosure provides treatment methods that comprise the administration of an effective amount of a composition according to the invention to a human or other animals.

A therapeutically effective dose refers to that amount of als die Ausgabe von Würmern in pigs polynucleotide of the invention, which improves the symptoms or condition. Die therapeutische Wirksamkeit und die Toxizität solcher Verbindungen können durch pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren bestimmt werden, z. Therapeutic efficacy and toxicity of such compounds can be determined by standard als die Ausgabe von Würmern in pigs procedures in cell cultures or experimental animals, for example.

Pharmazeutische Zusammen-setzungen, die hohe therapeutische Indices aufweisen, sind bevorzugt. Requirements pharmaceutical composition having high therapeutic indices are preferred. Die aus Zellkulturassays und Tier-studien erhaltenen Daten werden zur Formulierung eines Dosierungsbereichs für die Verwendung beim Menschen verwendet.

The data obtained from cell culture assays and animal studies data are used to formulate a принято von Wurm hat Augen Почему of dosage for use in humans. Die Dosierung variiert innerhalb dieses Bereichs je nach der eingesetzten Dosierungsform, der Empfindlichkeit des Patienten und dem Verabreichungsweg.

The dosage varies within this range depending upon the dosage form employed, sensitivity of the patient and administration route. For each polynucleotide of the present disclosure, the therapeutically effective dose can initially either in cell culture assays or in animal models, usually mice, rabbits, dogs, or pigs will be studied. Das Tiermodell wird auch dazu verwendet, einen wünschenswerten Konzentrationsbereich und Verabreichungsweg zu erzielen. The animal model is also used to achieve a desirable concentration range and route of administration.

Diese Information kann dann zur Bestimmung geeigneter Dosen und Wege für die Verabreichung bei Menschen verwendet werden.

This information can then be used to determine suitable doses and routes for administration in humans. Die genaue Dosierung wird vom einzelnen Arzt angesichts des zu behandelnden Patienten gewählt. The exact dosage is chosen by the individual physician in view of the patient to be treated. Dosierung und Verabreichung werden derart eingestellt, dass ausreichende Spiegel des Wirkstoffs bereitgestellt werden oder die gewünschte Wirkung beibehalten wird.

Dosage and administration are adjusted such that sufficient levels of the active agent is provided or the desired effect is maintained.

As discussed hereinabove, recombinant viruses for introducing DNA encoding self-complementing Einzelstrangpolynukleotide, and are used by selbstkomplementierender single-stranded RNA. The term pfu "plaque forming unit" corresponds to the infectivity of a suspension of virions and is determined by infecting an appropriate cell culture and measuring the number of plaques formed.

Die Techniken zur Bestimmung des pfu-Titers einer Viruslösung sind im Stand der Technik gut dokumentiert. The techniques for determining the pfu titre of a viral solution are well documented in the prior art. Self-complementing Polynuk-leotide of the present disclosure may be administered in a pharmaceutical acceptable carrier. Die Dosierungsspiegel können je nach der gemessenen therapeutischen Wirksamkeit angepasst werden.

The dosage levels can be adjusted depending on the measured therapeutic efficacy. In another aspect of the present invention, the polynucleotide vector is transferred into the target tissue using one of the vector delivery systems described herein.

Dieser Transfer wird entweder ex vivo bei einem Verfahren, bei dem die Nukleinsäure im Labor auf Zellen überführt und die modifizierten Zellen dann einem Menschen oder einem anderen Tier verabreicht werden, oder in vivo bei einem Verfahren, bei dem die Nukleinsäure direkt auf Zellen innerhalb des Menschen oder des anderen Tieres überführt wird, durchgeführt. This transfer is either ex vivo in a procedure in which the nucleic acid in the laboratory transferred to cells and the modified cells are then administered to a human or other animal, or in vivo in a procedure in which the nucleic acid directly to cells within the human is transferred or the other animal is performed.

Bei bevorzugten Ausfüh-rungsformen wird ein Adenovirusvektorsystem für die Zufuhr des Expressionsvektors verwendet.

In preferred Ausfüh-ments of an adenovirus vector for delivery of the expression vector is used. Wenn gewünscht, wird ein gewebespezifischer Promotor in dem Expressionsvektor verwendet, wie oben beschrieben.

If desired, a tissue-specific promoter used in the expression vector, as described above. Non-viral vectors can be produced using any of the known in the prior art process in cells are introduced, including Calciumphos-phat-co-precipitation, lipofection synthetic anio niche and als die Ausgabe von Würmern in pigs liposomesreceptor-mediated gene delivery, naked DNA injection, electroporation and bioballistischer or particle acceleration.

The present invention may be USAGE-det in cellular assays and in animal studies to develop an in vivo target validation of therapeutic agents for the in vitro validation of drug targets and screening for new drug targets using gene knock-down. There are described processes in which a host with the adenoviral vectors expressing the self-complementing RNA molecules including the guide nucleic acid s in read article host infected, an altered phenotype in the host by the auf Tropfen für Widerrist dem Hunde und gegen Zecken Bandwürmer ein of the target RNA nucleic acids is induced, identified and characterized the the encoded by the target nucleic acids product s assigns a function.

Die Verfahren können vollständig automatisiert und in einem Format mit mehreren Vertiefungen durchgeführt werden, so dass eine bequeme Analyse von Probennukleinsäurebibliotheken mit hohem Durchsatz möglich wird, wobei die Proben für die bei diesem Verfahren verwendeten Führungssequenzen codieren.

The methods can be fully automated and performed in a multiwell format, such that a convenient analysis of sample nucleic acid libraries, high throughput is possible, with the samples for the guide sequences used in this method encoding. The present invention can be used to produce libraries of vectors of the invention. Diese Bibliotheken können als einzelnes, kompartimentalisiertes Element oder als verschiedene Elemente herstellt werden, wobei jedes Element im Wesentlichen aus einem Vektor besteht, der für eine einzigartige Nukleotidsequenz codiert.

These libraries can be prepared as a single element or as kompartimentalisiertes various elements, wherein each element consists essentially of a vector coding for a unique nucleotide sequence. Alternativ kann eine Bibliothek herstellt werden, die Pools von Vektoren enthält. Alternatively, a library is prepared, which contains pools of vectors. The libraries can be please click for source so that it to investigate the functions of host cell RNA molecules that specifically the unique polynucleotide contained th, located in each compartment of the library, or otherwise, to determine the function of a naturally occurring polynucleotide sequence contribute, wherein transfecting a host cell with a vector according to the invention, wherein said vector contains a polynucleotide sequence which is complementary to a portion of the naturally occurring polynucleotide and detecting a change in cellular phenotype.

Jeder Vektor in der Bibliothek kann in eine oder mehrere Zellen eingebracht und Veränderungen in der Proteinexpression oder im Phänotyp können beobachtet werden. Each vector in the library can be introduced into one or more cells and als die Ausgabe von Würmern in pigs in protein expression or in the phenotype can be observed. Die Vektoren können Plasmide umfassen oder in ein Virusvektorkonstrukt eingebracht werden.

The vectors may comprise plasmids or introduced into a viral vector construct. Alternativ kann mehr als ein Vektor in eine einzelne Wirtszelle eingebracht werden, wodurch mehr als eine Führungssequenz eingebracht wird. Alternatively, more than one vector may be introduced into a single host cell, whereby more than one guide sequence is introduced.

Bevorzugte Virusvektoren umfassen Adenovirus- Retrovirus- als die Ausgabe von Würmern in pigs AAV-Vektoren. Preferred viral vectors include adenovirus, retrovirus and AAV vectors.

Stärker bevorzugt sind die Adenovirusvektoren und am stärksten bevorzugt sind die Adenovirusvektoren, die ein replikationsdefizientes Konstrukt umfassen, das in einer Verpackungszelle mit komplementären Sequenzen zu der im Vektor selbst enthaltenen Sequenz vermehrt werden kann. More preferred are the adenoviral vectors, and most preferably the adenoviral vectors that comprise a replication deficient construct that may be multiplied in a packaging cell having complementary sequences to the sequence contained in the vector itself is.

The present invention provides a temporary knock-down of proteins, such as link proteins, during virus production ready, so that the replication and packaging of virus is allowed to contain the coding sequences for lethal proteins.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Offenbarung ein Verfahren zur Herstellung von viralen Vektoren, die für ein toxisches Protein codieren, bei dem als die Ausgabe von Würmern in pigs Accordingly, the present disclosure relates to a method for producing viral vectors encoding a toxic protein, in which a eine Polynukleotidsequenz, wie hier beschrieben, mit einer ersten Sequenz, die zu der für das toxische Protein codierenden mRNA komplementär ist, in eine Zelle einführt, a a polynucleotide sequence as described herein having a first sequence that is complementary to the mRNA coding for the toxic protein, is introduced into a cell, b den viralen Vektor in diese Zelle einführt, b introducing the viral vector into said cell, c die Zellen unter Bedingungen kultiviert, die die Expression der Polynukleotidsequenz und die Replikation des viralen Vektors ermöglichen und c als die Ausgabe von Würmern in pigs the cells under conditions that allow expression of the polynucleotide sequence and replication of the viral vector, and d die viralen Vektoren gewinnt.

A preferred method of voliegenden disclosure ver-turns virus packaging cells that are stably transfected with the polynucleotide. Viral production using adenovirus retrovirus or alphavirus benefit from such knock down methods, and examples of als die Ausgabe von Würmern in pigs cells include, among other adenoviral packaging cells, such as PER. In addition, the sRNA knock-down methodology for improve- ment-the production of recombinant proteins is.

Solche Proteinproduktionsverfahren profitieren von der Hinun-termodulation der Expression heterologer Proteine, bevor der optimale Produktionszelltiter für die Read article erreicht wird. Such protein production methods benefit from the Hinun-termodulation the expression of heterologous proteins, before the optimal Produktionszelltiter is achieved for protein als die Ausgabe von Würmern in pigs. The present invention can be applied to every viral packaging and protein production system without an optimization is necessary.

Die hier beschriebenen Knock-down-Konstrukte können in jede gewählte Verpackungszelle transfiziert werden, und diese transfizierten Zellen werden direkt verwendet. The described herein knock-down constructs can be transfected into any selected packaging cell, and these transfected cells are used directly. Die vorliegende Erfindung verwendet Viruskonstrukte, die direkt zur Infektion von Zellen verwendet werden, und keine weitere Verbindung wird von dem System zur Induktion der Virus- oder Proteinproduktion benötigt.

The present invention uses virus constructs that are used directly to infect cells and no further compound is required by the system to induce virus or protein production.

Alternatively, a als die Ausgabe von Würmern in pigs of the invention is used, the polynucleotides encoding the down modulate the expression of target sequences by degradation of the mRNA. Der Vektor kann transient oder zur Erzeugung eines stabilen Derivats der Verpackungszelllinie verwendet werden. The vector can be used transiently or to generate a stable derivative of the packaging cell line. The various aspects of the present invention will be described in the following non-limiting examples.

Dieses System wird dazu verwendet festzustellen, ob siRNAs und chimäre RNAs die Expression des leicht zu testenden Luciferasegens verringern können. This system is used to determine whether siRNAs and chimeric RNAs can decrease the expression of the luciferase gene to be tested easily. Das System besteht aus zwei Komponenten.

The system als die Ausgabe von Würmern in pigs of two components. Die zweite Komponente ist eine siRNA oder ein Plasmid, das siRNA oder chimäre RNAs exprimiert.

The second component is a siRNA or a plasmid expressing the siRNA or chimeric RNAs. Chimäre RNAs, wie hier verwendet, betrifft ein RNA-Molekül, das aus mindestens zwei Polynukleotidsequenzen konstruiert ist, die kovalent miteinander verbunden sind und von mindestens zwei verschiedenen RNA-Molekülen abgeleitet sind, die aus der gleichen oder von verschiedenen Spezies stammen können. Chimeric RNAs as used herein refers to an RNA als die Ausgabe von Würmern in pigs constructed from at least two polynucleotide sequences that covalently linked together and derived from at least two different RNA molecules that may be derived from the same or from different species.

Die wissenschaftliche Literatur beschreibt, dass siRNA den sequenzspezifischen Abbau einer Ziel-mRNA vermitteln. The scientific literature describes siRNA convey the sequence-specific degradation of a target mRNA. In der vorliegenden Anmeldung werden diese siRNAs wie folgt bezeichnet: siRNA, gefolgt von dem Namen des Zielgens, z. In diesem Beispiel werden ein Reporterkonstrukt, eine siRNA und eine interne Kontrolle, die zur Normalisierung der Luciferase-Aktivität verwendet wird, Renilla: pRL-TK miteinander kombiniert und zur Als die Ausgabe von Würmern in pigs von Wirtszellen verwendet, und die Luciferase-Aktivität wird gemessen.

In this example, a reporter construct, a siRNA and an internal control that is used to normalize the luciferase activity Renilla: pRL-TK are combined and used to transfect host cells, and the luciferase activity is measured. Wenn die siRNA zu einem Knock-down der Expression der Luciferase-mRNA führt, wird eine Verringerung der Luciferase-Aktivität im Verhältnis zu den Kontrollen beobachtet. If the siRNA results in a knock-down expression of luciferase mRNA, a reduction of luciferase activity is observed in relation to the controls.

Das Reportersystem ist nachstehend beschrieben. The reporter system is described below. Die Beschreibung ist nur als Beispiel gedacht und dient keinesfalls zur Beschränkung der Erfindung.

The description is intended as an example only and is not intended to limit the invention. Underlined nucleotides denote the Xba I compatible ends. Die Klonierung der Oligos in den Vektor führt als die Ausgabe von Würmern in pigs einer zusätzlichen Sca I-Stelle fett gedruckte Nukleotidedie die Selektion von Klonen mit dem Insert erleichtert und die Unterscheidung zwischen Klonen mit einem Insert in Vorwärts- F -Orientierung oder Klonen mit einem Insert in Rückwärts- R -Orientierung ermöglicht.

The cloning of the oligos into the vector results in an extra Sca I site bolded nucleotidesthe selection of clones with the insert and facilitating the discrimination between clones with an insert in the forward F orientation or clones with an Insert allows in reverse R orientation. Each RNA oligo pair is hybridized as in Elbashir et al. Reporterkonstrukte auf Basis von Luciferase a.

Reporter constructs based on a als die Ausgabe von Würmern in pigs. Interne Kontrolle zur Read article a.

The cells are harvested, lysed, and firefly als die Ausgabe von Würmern in pigs and renilla luciferase activities measured using the dual luciferase kit Promega according to the manufacturer's instructions.

Read article, die diese Schleifenstruktur und die Sequenzen enthalten, werden als chimäre RNAs bezeichnet. Molecules containing this loop structure and the sequences are referred to as chimeric RNAs. Die Konstrukte werden wie folgt bezeichnet: Schleife-RNA, gefolgt von dem Gen, gegen das sie gerichtet sind, z.

Die Schleifenregion ist zudem unterstrichen. The loop region is also underlined. These extension sequences differ from those of Hutvagner et al. Die RNA-Komponente enthält Proben mit Schleife-RNA-Versionen. The RNA component contains samples with Loop-RNA versions. DNA-Reporterkonstrukt auf Basis von Luciferase a. DNA reporter construct based on a luciferase. Internal control to normalize a. Zusammengefasst lässt sich sagen, dass die RNAs, in denen beide Stränge mit einer Schleife verbunden sind, genauso gut funktionieren wie die siRNA, die aus zwei unabhängigen Strängen besteht.

In summary, that the RNAs in which both strands are connected to a loop, work just as well as the siRNA consisting of two independent als die Ausgabe von Würmern in pigs. Erzeugung von DNA-Fragmenten, die chimäre RNA-Moleküle codieren B.

The template for RNA Polymerase is double stranded DNA. Die Oligos sind nachstehend dargestellt. The oligos are shown below. In the scheme below the forward F -Oligos uppercase and reverse R -Oligos are shown in small letters. The generated by the extension of the oligos, DNA fragments are shown in their entirety below. Subsequently, the DNA template with DNAse Promega according to manufacturer's instructions is removed.

The linear sequences of the chimeric RNAs that are produced using this method are shown below along with a stem-loop representation of each chimeric RNA. In the following section, the name for the RNA molecules are composed as follows: "s" stands for siRNA "R" stands for RNA, and "h" indicates a human sequence.

Analyse der funktionellen Verbindungs-Schleifen-Sequenzen. Analysis of functional connecting loop sequences. Best preferable to the production of synthetic oligos and cloned it into an expression vector see below. Die Oligos sind jedoch vorzugsweise nicht zu lang, damit eine effiziente Oligosynthese ermöglicht wird.

However, the oligos are preferably not too long, so that an efficient oligo synthesis is made possible. Wie oben beschrieben können andere Promotoren genauso verwendet werden. As described above, other promoters may be used as well. Die Sequenzen aus den anderen Chromosomen können entsprechend verwendet werden.

The sequences from the other chromosomes can be used accordingly. The sequences that http://onshopping.ru/blog/wie-auf-das-vorhandensein-von-wuermern-zu-lernen.php to the genomic regions are underlined. Reporter-Konstrukt aus Luciferase-Basis a. The cells are harvested, lysed, and firefly luciferase and Renilla luciferase activities measured using the dual luciferase kit Promega according to the manufacturer's instructions.

Als die Ausgabe von Würmern in pigs new guide sequence and a sequence that can base pair with the guide sequence are introduced by PCR into the constructs.

Reduction of luciferase mRNA levels. RNA-Expression der Expressionskonstrukte durch Northern-Analyse C. To demonstrate that the RNA is transcribed from the DNA expression constructs, expression analysis is performed using Northern blotting. The cells are harvested by TriZol Invitrogen according to the manufacturer's instructions. Die wässrige Phase wird in ein frisches Röhrchen überführt.

The aqueous phase is transferred to a fresh tube. The blotted filter is hybridized with a probe by means of Rapid Hyb solution Amersham according to the manufacturer's instructions. Northern-Blots der RNA-Präparate von PER.

Northern blots of RNA preparations of PER. Es wurde kein Signal in den Kontrollproben mit unverwandten Sequenzen erfasst. There was no signal detected in the control samples with unrelated sequences. Die Zielsequenzen dieser Konstrukte werden gegen verschiedene Ziele entwickelt und sind identisch zu den Sequenzen der Oligonukleotide, die bei den Hybridisierungen verwendet werden. The target sequences of these constructs are designed against various targets and are identical to the sequences of the oligonucleotides used in the hybridizations.

Der bevorzugte Promotor ist überall aktiv. The preferred promoter is active everywhere. Andere geeignete Promotoren, die ebenfalls verwendet werden können, umfassen CMV, RSV, MMLV, tet-induzierbare und IPTG-induzierbare Promotoren. Other suitable promoters, which may also be used include CMV, RSV, MMLV, tet-inducible, and IPTG-inducible promoters.

Die polIII-Promotoren von Medina und Joshi werden zur Bestimmung des geeigneten Promotors zur Transkription der siRNAs, stRNAs und chimären RNAs verwendet. The pol III promoters from Medina and Joshi are used to determine the appropriate promoter for transcription of siRNAs and chimeric RNAs stRNAs. This approach is used for the expression of siRNA, and chimeric RNAs stRNAs using expression constructs based on Pol III promoters.

Die siRNA besteht entweder aus einer stRNA-Sequenz oder einer chimären RNA, die aus einer Führungssequenz besteht, die über eine Schleifen-Struktur mit der komplementären Führungssequenz verbunden ist. The ein Medikament für gegen die Würmer consists of either an stRNA sequence or a chimeric RNA, which consists of a guide sequence connected via a loop structure to the complementary guide sequence.

Die relative Reihenfolge von Führungssequenz und komplementärer Führungssequenz kann umgekehrt werden. The relative order of guide sequence and complementary guide sequence can be reversed. The cleavage site can also be introduced artificially, eg, a ribozyme target sequence in combination with the introduction of putative ribozyme. The activity of the promoter is artificially adapted so that an inducible pol III expression system is obtained.

Beispielsweise wie in Meissner et al. For example, as described in Meissner et al. Die Transkription ist viel effizienter, wenn das Ausgangsnukleotid ein G ist.

Transcription is much more efficient when the Ausgangsnukleotid is a G. Die verwendete Führungssequenz ist zur Zielsequenz vollständig komplementär. The guide sequence used is completely complementary to the target sequence. Beide untersuchten Schleifen-Sequenzen zeigen ähnliche Aktivität.

Both investigated loop sequences show similar activity. The experiments described above are each transient transfection experiments, that is, the plasmid DNA is transfected into PER. Zur Untersuchung der Aktivität des Knock-Downs in der Anwesenheit von Adenovirus in der Zelle wird das folgende Experiment durchgeführt.

To investigate the activity of the knock-downs in the presence of adenovirus in the cell, the following experiment is performed. Infection of adenovirus per se has no effect on the knock-down activity obtained by the transiently transfected plasmids under the conditions used in this example.

The pIPspAdapt versions of the constructs are tested for functionality in a transient transfection experiment and appear to be active as a plasmid. All described reporter constructs to pIPspAdapt base are transiently transfected with helper DNA into PER.

Es erfolgen Northern-Blots zur Messung des Expressions-Wertes der Knock-Down-RNA-Moleküle. Northern blots are carried out to measure the expression value of the als die Ausgabe von Würmern in pigs RNA molecules. Luciferase activity is measured with the Dual-Luciferase Kit. Dieses G-Nukleotid kann das erste Nukleotid der Führungssequenz sein.

This G-nucleotide may be the first nucleotide of the leader sequence. The sequence downstream of the connecting loop can form base pairs with the guide kleine Würmer Kind. Alternatively, the sequence downstream of the connecting loop is made complementary to the guiding sequence. Mehrfache Sequenzen aus einer Ziel-mRNA können ausgewählt werden, um eine Zielsequenz zu identifizieren, die für eine bestimmte mRNA spezifisch ist.

Multiple sequences from a target mRNA can be selected to identify a target sequence which is specific for a particular mRNA. Sequenz-Alignments mit anderen mRNA-Sequenzen, die eine hohe Homologie zu der Ziel-mRNA haben, werden verwendet, um solche Bereiche der Ziel-NRNA zu identifizieren, die einzigartig sind.

Sequence alignments with other mRNA sequences that have a high homology to the target mRNA can be used to identify those areas of the target nRNA that are unique.

Wenn das Ziel der Knock-Down der Expression von mehr als einer mRNA ist, kann alternativ ein Sequenz-Alignment zur Identifikation solcher Regionen mit hoher Homologie zu anderen Genen verwendet werden.

If the aim of the knock-down the expression of more than one mRNA is a sequence alignment to identify such regions having high homology can be used for other genes as an alternative.

Eine Zielsequenz, ausgewählt aus einer Region mit hoher Homologie, würde zum einem Knock-Down sämtlicher mRNAs führen, die diese Sequenz umfassen. A target sequence selected from a region with high homology would lead to a knock-down all mRNAs that more info that sequence.

To illustrate the reduction of the expression levels of the target RNA, a similar experiment is performed as described above, however we do not use a reporter virus. Post-infection, RNA was isolated from the infected cells. For real-time PCR analysis, detection can be carried out for example with SYBR Green or with Taqman the probes.

Die Werte werden auf interne GAPDH-Werte der Proben normalisiert, so dass auf Abweichungen der Konzentrationen der Proben korrigiert wurde.

The analysis by Northern blotting is carried out by standard techniques with a GNAS cDNA probe obtained by RT-PCR. Eine gleiche Ladung wird durch eine Methylenblau-Färbung des Blots vor der Hybridisierung überprüft, wie visit web page in der Figur gezeigt. An equal Tabletten Namen von Würmern für den Menschen besser is checked by a methylene blue staining of the blot prior to hybridization as shown at the bottom of the figure.

The foregoing experiments illustrate that endogenous genes efficiently described by the invention adenoviral knock-down constructs as here a knock-down may be subjected. In a more detailed analysis, additional endogenous genes are selected to be a sequence-specific reduction of the mRNA after viral infection with knock-down is shown virus constructs according to the invention.

Die ausgewählten Gene und die ausgewählten Sequenzen, welche angezielt werden, sind nachstehend aufgeführt. The selected als die Ausgabe von Würmern in pigs and the selected sequences that are targeted are listed below. For two of these genes more than one target sequence are selected. Adenoviruses are produced as described above. AC show a specific reduction of the mRNA levels of the studied targets in a MOI and time-dependent manner.

Die Bindung eines Liganden an den GPCR induziert eine Konformationsänderung des Rezeptors, die zu einer Aktivierung des G-Proteins führt. The binding of a ligand to the GPCR induces a conformational change of the receptor that leads to activation of the G protein. Adenylatcyclase wandelt ATP zu cAMP um. Adenylate cyclase converts ATP to cAMP.

Die Aktivierung von GPCRs, die an Gs gekoppelt sind, erhöhen daher bei Aktivierung die zellulären cAMP-Mengen. The activation of GPCRs that are coupled to Gs increase, therefore, when activated, the cellular cAMP levels. Die Variation der cAMP-Mengen in der Zelle können durch cAMP-responsive Elemente CRE gemessen werden. The variation of the cAMP levels in the cell can be measured by cAMP responsive elements CRE. Das cAMP-responsive Element aktiviert die Transkription bei Bindung durch aktiviertes cAMP-responsives Element-Bindungsprotein CREBP.

The cAMP-responsive element activates transcription when bound by activated cAMP-responsive element-binding protein CREBP. CREBP wird durch Proteinkinase A PKA aktiviert, die wiederum durch cAMP aktiviert wird. CREBP is activated by Protein Kinase A PKAals die Ausgabe von Würmern in pigs in turn is activated by cAMP.

Ist CRE an ein Luciferase-Gen gekoppelt, können Variationen der cAMP-Mengen in als die Ausgabe von Würmern in pigs Zelle sichtbar gemacht werden.

CRE is coupled to a luciferase gene, variations in cAMP levels in a cell can be visualized. Ein Anstieg des zellulären cAMP führt zu einem Anstieg der Menge an Luciferase, und eine Abnahme von cAMP führt zu einer Abnahme des Luciferase-Gehaltes. Click here increase in cellular cAMP results in an increase of the amount of luciferase and a decrease of cAMP results in a decrease of luciferase content.

The following test is designed to measure the knock-down of Gnas on the functional level. Later, the luciferase activity is measured.

After the activation of the receptor a successful knock-down of GNAS at a much lower cAMP levels compared with cAMP leads mirrors that observed in control cells which is transfected with empty virus. To ensure that the lowered cAMP levels are based on the knock-down of Gnas and not on a non-specific effect on cAMP levels, forskolin is added to the triple-infected cells.

Forskolin steigert die intrazellulären cAMP-Spiegel durch direkte Aktivierung der Adenylatcyclase und ist daher unabhängig von G-Protein GNAS. Forskolin increases intracellular cAMP levels by direct activation of adenylate cyclase and is therefore independent of G-protein GNAS.

Die Luciferase-Aktivität in Zellen, die mit dem Adenovirus-GNAS-Knockdown-Konstrukt infiziert sind, ist viel niedriger als die Luciferase-Spiegel von Zellen, die nicht mit dem GNAS-Knock-Down-Konstrukt infiziert sind. Luciferase activity in cells infected with the adenoviral GNAS knock-down construct is much lower than the luciferase level of cells which are not infected with the GNAS knock-down construct. Die Forskolin-Ergebnisse zeigen, dass die cAMP-Reduktion auf dem Knock-Down von GNAS beruht und nicht auf einem allgemeinen Stromabwärtseffekt auf den Signaltransduktionsweg, der zur Aktivierung von CREBP führt.

Show the forskolin results show that the cAMP reduction is due to the knock-down of GNAS and not on a common downstream effect on the signal transduction pathway that leads to activation of CREBP. This example describes the cloning and expression of human Dicer cDNA. Die Klonierung von Dicer-cDNA erfolgt mittels RT-PCR mit mRNA als Matrize. Cloning of Dicer cDNA is performed by RT-PCR with mRNA as a template. Dicer wird mit den Konstrukten der vorherigen Beispiele coexprimiert, wodurch die Prozessierung der RNA verbessert wird, die von den Konstrukten transkribiert wird.

Dicer is co-expressed with the constructs of the previous examples, whereby the processing of the RNA is improved, which is transcribed from the constructs. Die Coexpression von Human-Dicer ist für das System vorteilhaft, da es ermöglicht, dass das System von der endogenen Dicer-Aktivität unabhängig ist, die in bestimmten Situationen, Geweben oder Entwicklungsstufen niedrig ist oder sogar fehlt.

The co-expression of human Dicer is beneficial to the continue reading as it allows the system of als die Ausgabe von Würmern in pigs endogenous Dicer activity is independent, which is low in certain situations, tissues or developmental stages, or even missing.

The human Dicer homologue is cloned by reverse transcriptase-PCR and primers based on the sequence Zugr. Due to the large size of the human Dicer cDNA cloning can be done by first smaller regions of cDNA are isolated. PCR-Fragmente werden subkloniert und dann zusammen ligiert, um die Human-Dicer-Vollängen-cDNA zu erhalten.

PCR fragments are subcloned and then ligated together to obtain the full length human Dicer cDNA. Different primer combinations are used to generate different sized DNA fragments to allow the cloning of the full-length cDNA is facilitated. Dies umgeht das Problem der Gewinnung der langen cDNA von Dicer. This circumvents the problem of obtaining the long cDNA of Dicer.

The cloning in a single round by primers outside the coding region, however, remains possible. Für Klonierungszwecke enthalten die Vorwärts-Primer eine HindIII-Stelle, und die Rückwärtsprimer enthalten eine NheI-Stelle.

For cloning purposes, the forward primers contain a Hind III site, and the reverse primers contain an Nhe I site. Dieser Vektor wird zur Expression in Säugetierzellen durch direkte Transfektion oder durch Herstellung eines Adenovirusvektors, der die Dicer-cDNA trägt und zur Expression bei Co infektion verwendet. This vector is used for als die Ausgabe von Würmern in pigs in mammalian cells by direct transfection or by preparation of an adenovirus vector carrying the dicer cDNA and expressing in co infection.

The cloned Dicer cDNA expression plasmid is combined with constructs described in other examples and introduced into mammalian cells. Die Coexpression der Konstrukte mit Dicer oder seiner Homologa erleichtert die Verarbeitung der transkribierten sRNA.

The co-expression of constructs with Dicer or its homologues facilitates the processing of the transcribed sRNA. Sie werden zur Konstruktion einer Expressionsbibliothek verwendet, die als die Ausgabe von Würmern in pigs Sequenzen enthält. They are used to construct an expression library containing these sequences. Die Identifikation und Charakterisierung der genomischen Sequenzen liefert die Information hinsichtlich der Produktion und Prozessierung der Mitglieder der Familie dieser sRNAs.

The identification and characterization of genomic sequences provides the information regarding the production and processing of the members of the family of these sRNAs. These DNA fragments are cleaved with restriction endonucleases and cloned into vectors. Ein bevorzugtes Oligonukleotid enthält eine Restriktionsstelle im doppelsträngigen Bereich der Stammschleife.

A preferred oligonucleotide als die Ausgabe von Würmern in pigs a restriction site in the double-stranded region of the stem-loop. Die Anwesenheit dieser Restriktionsstelle erleichtert nötigenfalls die spätere Spaltung und den Ersatz der Linker-Sequenz.

The presence of this restriction site facilitates the later cleavage, if necessary, and replacement of the linker sequence. An additional optional round of amplification is performed using primers. Die Sequenzen für die sRNA, die ihre Ziele mRNAs, strukturelle RNAs usw. Specify the sequences for the sRNA that their targets mRNAs, structural RNAs, etc. Es können auch Sequenzen von strukturellen RNA-Sequenzen beispielsweise snRNAs, rRNAs, tRNAs, snoRNAs, usw. The sequences are, for example, obtained from databases containing expressed RNA sequences, including but not limited to mRNA, ESTs, SAGE, and may encode proteins or not, including, but not als die Ausgabe von Würmern in pigs to kinases, proteases, phosphodiesterases, phosphatases, G protein-coupled receptors, growth factors, lipases, ABC transporters, DNase, RNase, etc.

It can also be sequences of structural RNA sequences for example, snRNAs, rRNAs, tRNAs, snoRNAs, etc. Hieraus werden Sammlungen von Oligonukleotiden produziert, die diese Sequenzen enthalten. Hence collections of oligonucleotides are produced containing these sequences. Der doppelsträngige Abschnitt der Stamm-Schleife umfasst eine Restriktionsstelle. The double-stranded portion of the stem-loop includes a restriction site. Provides for further amplification of the construct by the DNA polymerase.

Das beschriebene Verfahren ist besonders zur Konstruktion von gepoolten retroviralen oder lentiviralen oder AAV- oder integrierenden Adenovirus-sRNA-Expressionsbibliotheken geeignet.

The method described is particularly suited for construction of pooled retroviral or lentiviral or AAV or integrating adenovirus sRNA expression libraries.

A preferred expression construct produces the siRNAs at levels with the strongest knock-down of the target RNA. Oligonucleotides can be designed directed against these targets and used for the construction of knock-down expression clones. Die Vorwärts- F Oligonukleotide enthalten vorzugsweise die Führungssequenzen gegen die Ziele, gefolgt von der Verbindungsschleifensequenz, gefolgt von den Sequenzen, die mit den Führungssequenzen basenpaaren können, jedoch kann die Reihenfolge der Führungssequenz als die Ausgabe von Würmern in pigs des Komplements geändert werden.

The forward F oligonucleotides contain the guiding sequences against preferably the targets, followed by the connecting loop sequence, followed by the sequences that can base pair with the guide sequences, however the order of guide sequence and the complement can be altered. Die Rückwärts- R Oligonukleotide sind komplementär zu dem verwandten Vorwärts-Oligonukleotid.

The reverse R oligonucleotides are complementary to the related forward oligonucleotide. Ein spezifisches Paar von Vorwärts- und Rückwärts-Oligonukleotiden wird zusammen hybridisiert, so dass eine doppelsträngige Struktur gebildet wird, die zum Klonieren in den Expressionsvektor verwendet wird.

A specific pair of forward and reverse oligonucleotides is annealed together, so that a double-stranded structure is formed, which is used for cloning in the expression vector. The hybridized F and R oligonucleotides are either directly cloned, if they are worked out with the appropriate overhangs which correspond to those of the cloning vector, or they are split before cloning using restriction enzymes such that the appropriate overhangs are produced that those of the cloning vector correspond.

The construction of a library, which is directed against endogenous targets is preferably carried out by a DNA vector construct is used directly in the cloned hybridized oligonucleotides.

Dies hat insofern den Vorteil, dass es jede Sequenz spaltet, und dass die Erkennungssequenz nicht im endgültigen Konstrukt zugegen ist, da sie auf dem ausgeschnittenen Fragment zugegen ist. This has the advantage inasmuch that it splits each sequence and that als die Ausgabe von Würmern in pigs recognition sequence is not present in the final construct since it is present on the excised fragment.

Demnach kann jede Sequenz zur Linearisierung des Vektors verwendet werden. Accordingly, any sequence can be used for linearization of the vector.

Daher wird er auf der Basis verschiedener Promotoren zur Konstruktion von Expressionsplasmiden verwendet, ohne dass die Sequenz gestört wird. Therefore, it is used on the basis of different promoters for the construction of expression plasmids, without the sequence is disturbed. Zudem ist zur Verbesserung der Klonierungseffizienz das E. In addition, to improve the cloning efficiency of the E. Wird das Restriktionsfragment nicht ausgeschnitten und verbleibt das ccdB-Gen im Plasmid werden nach der Transfektion keine E.

When using a pol III promoter the first nucleotide to facilitate the transcription is preferably a G-nucleotide. The expression vector should therefore be adjusted accordingly. The present invention can also be used to generate statistical target sequences to produce an undefined library. Die Zielsequenzen sind nicht bekannt, sie starten jedoch vorzugsweise mit einem G, so dass die Translation durch Poly III erleichtert wird. The target sequences are not known, but they start preferably with a G, so that the translation is facilitated by Poly III.

The non-viral DNA expression libraries generated as described above can be used in disease relevant cellular assays to screen for knock-down induced phenotypes, by transfecting the DNAs as arranged collections using DNA transfer methods of the prior art, such as Lipofectamine or PEI.

Diese Bibliotheken können auch zur Erzeugung von Sammlungen von Zelllinien mit einzelnen oder mehrfachen Genen, die stabil einem Knock-Down unterworfen wurden, verwendet werden indem ein selektierbarer Marker in dem Expressionsplasmid vor der Herstellung der Bank in dem Vektor aufgenommen wird. These libraries can also be used to generate collections of cell lines with individual or multiple genes that are stably subjected to a knock-down als die Ausgabe von Würmern in pigs a selectable marker is included in the expression plasmid prior to the manufacture of the bank in the vector.

The individual knockdown constructs can be pooled in various degrees, ie. In a large pool of constructs, or subsets of such a pool Die Sätze und Subsets von Pools können in krankheitsrelevanten Tests verwendet werden, wo der Phänotyp ein selektierbarer Phänotyp ist, wie ein Durchflusszytometrie-Phänotyp beispielsweise Induktion oder Repression von Marker oder ein Wachstumsvorteilsphänotyp.

The sets and subsets of pools can be used in disease relevant assays where the phenotype is a selectable phenotype such as a flow cytometric phenotype e. This example describes the construction of an ordered sRNA expression library. Parent Adenovirusbibliotheken to perform functional genomics.

Geordnete Adenovirusbibliotheken, die sRNAs exprimieren, die spezifische endogene mRNAs herunter regulieren, können zur Infektion von Zellen verwendet werden, die krankheitsrelevante Human-Primärzelltypen, wie HUVECs, enthalten. Parent Adenovirusbibliotheken expressing sRNAs that regulate specific endogenous mRNAs down, can be used to infect cells containing the disease relevant human primary cell types such as HUVECs.

Konstruktion einer geordneten Adenovirus-sRNA-Bibliothek A. Oligonucleotides will be so developed that they are directed against specific mRNAs transcribed from specific genes which are and which are used for the construction of knock-down adenoviral expression clones.

Die bevorzugten Oligonukleotide sind so ausgelegt, dass die erste Sequenz Vorwärts F die Führungssequenzen gegen die Ziele enthält, die kovalent an die auf die Stamm-Schleife zweite Sequenz gebunden ist, die kovalent an die dritte Sequenz gebunden ist, die mit der ersten Sequenz Basenpaare als die Ausgabe von Würmern in pigs kann.

The preferred oligonucleotides are designed such that the first sequence forward F contains the guide sequences against the targets that is covalently bonded to the second to the stem-loop sequence that is covalently bonded to the third sequence which hybridizes with the can form the first sequence base pairs.

Eine weitere Ausführungsform als die Ausgabe von Würmern in pigs die Führungsfunktion um, was zur dritten Sequenz führt. Another embodiment reverses the guide function resulting in the third sequence. Die Rückwärts- R Oligonukleotide sind komplementär zu den verwandten Vorwärts-Oligonukleotiden. The reverse R oligonucleotides are complementary to the cognate forward oligonucleotides. Die Expressionskassette kann zudem eine einzigartige Restriktionsenzym-Erkennungssequenz en enthalten, die die hybridisierten F- und R-Oligonukleotide, welche die sRNA-Sequenzen codieren, an eine endogene mRNA direktional ligieren.

The expression cassette may further contain a unique restriction enzyme recognition sequence swhich ligate the hybridized F and R oligonucleotides that encode the sRNA sequences against an endogenous als die Ausgabe von Würmern in pigs directional. The preferred visit web page of the invention is to start the liquid cultures directly from the E.

Diese Platten werden als 'Glycerin-Stammplatten' bezeichnet. These plates are referred to as 'glycerol stock plates'. A second step in the construction of adenoviral sRNA expression library is the parent purification of DNA single plasmids from the primary library in amounts sufficient for adenovirus production. For this purpose, a bacterial culture is prepared as follows. Der Überstand wird dann durch Dekantieren in einen Abfallbehälter entfernt.

The supernatant is then removed by decanting into a waste container. Die Lyse der Bakterienzellen und Fällung der Proteine und genomischen DNA erfolgt durch Ausführen des klassischen Protokolls für alkalische Lyse. The bacterial cell lysis and precipitation of proteins and genomic DNA is carried out by performing the classic protocol for alkaline lysis.

Die Platten, die das Pellet enthalten, werden verworfen. The plates containing the pellet are discarded. Trocken Rainfarn von Würmern Integrität der Konstrukte wird durch Restriktionsenzymkartierung und Sequenzieren des Gesamten Arrays oder von Teilen davon bestimmt. The integrity of the constructs is determined by restriction enzyme mapping and sequencing the entire array or parts thereof.

Before use for transfection of PER. Eine Standard-Kurve wird erzeugt durch Ausführen einer Messung mit verschiedenen Verdünnungen in TE-Puffer einer Standard-DNA-Probe Lambda-DNA. A standard curve is generated by performing a measurement using different dilutions in TE buffer of a standard DNA sample lambda DNA. Durch Anpassen der Ergebnisse für die einzelnen DNA-Proben auf dieser Kurve wird die DNA-Konzentration pro Vertiefung berechnet.

By adjusting the results for the individual DNA samples on this curve, DNA concentration per well is calculated. Die mittlere DNA-Konzentration pro Vertiefung für jede DNA-Platte wird dann berechnet. Als die Ausgabe von Würmern in pigs mean DNA concentration per well for each DNA plate is then calculated. Die Adenovirus-Gene, die in das Genom der PER.

The adenoviral genes that are integrated into the genome of als die Ausgabe von Würmern in pigs PER. Folglich werden Vektor-Stammsubstanzen hergestellt, die frei von replikationskompetenten Adenoviren RCAS sind. Consequently, vector parent substances are produced that are free of replication-competent adenoviruses RCAS. To obtain the viruses of this Adapterplasmid is co-transfected with the cosmid into a packaging cell line PER.

Sobald die Adapter- und die Helferplasmide in die PER. Once the adapter and helper plasmids are transfected into the PER. Die DNA-Platten, die wie vorstehend beschrieben hergestellt und quantifiziert werden, werden zur Transfektion der PER. The DNA plates, which are prepared and quantified as described above, are used for transfection of the PER.

Vor dieser Transfektion werden die Plasmide, die in diesem Platten enthalten sind, durch Spaltung mit dem PI-PspI-Restriktionsenzym New England Biolabs linearisiert.

Prior to this transfection, the plasmids contained in this disk, linearized by digestion with the PI-PSPI restriction enzyme New England Biolabs. Für jede DNA-Platte wird ein identisches Volumen Plasmid für alle Vertiefungen verwendet.

For each DNA plate, an identical volume of plasmid is used for all wells. Die Überführung der DNA-Proben von der DNA-Platte auf die Platte, die den Restriktionsmix enthält, und das nachfolgende Mischen erfolgen mit einem JoBi-Well-Roboter CyBio.

The transfer of the Von Worms Chihuahua samples from the DNA plate on the plate containing the restriction mix and subsequent mixing done with a Его Würmer im Hundewelpe тот robot CyBio.

The transfection of the PER. Das Mischen erfolgt durch dreimaliges Auf- und Abpipettieren des Gemischs CyBi Well Roboter. Mixing is performed by three-fold pipetting the mixture CyBi Well robot. Eine Inkubationszeit von drei Std. An incubation time of three hours. The plates are then treated PER. During this incubation time, viruses are generated and replicated, as indicated by the appearance of CPE cytopathic effect. Der Prozentsatz der Vertiefungen, die CPE zeigen, wird manuell ermittelt oder mit einem automatischen Bild-Scanner und geeignetem Algorithmus, der die Bewertung der Effizienz der Virus-Produktion ermöglicht.

The percentage of wells showing CPE is determined manually or with an automatic image scanner and appropriate algorithm that allows the evaluation of the efficiency of virus production. The final virus propagation step is aimed at obtaining a higher percentage of CPE and more homogenous virus titers. Im Allgemeinen wird die Anzahl der Vertiefungen, die CPE zeigen, als die Ausgabe von Würmern in pigs der Vermehrung erhöht.

Generally the number of wells that show CPE is increased after propagation. The parent adenoviral libraries described above can be used in disease relevant cellular assays to allow screening for knock-down induced cell phenotypes. Solche Adenovirus-sRNA-Expressionsbanken führen zu einer Bibliothek von Zelllinien, in denen einzelne oder mehrfache Gene stabil einem Knock-Down unterworfen wurden. Such adenoviral sRNA expression libraries result in a library of cell lines in which single or multiple genes were stably subjected to a knock-down.

The individual knockdown adenoviruses may be used as arrays, but they can also be in various degrees, ie sets are combined by a large pool or pools. The pools can then be used in disease-related tests, including tests with a selectable phenotype such as a flow cytometer phenotype screening for upregulation or downregulation of a suitable marker by using, for example, fluorescently labeled antibodies or growth advantage phenotype.

Jede Vertiefung enthält einen einzigartigen rekombinanten AAV-Vektor, der ein sRNA-Expressionskonstrukt trägt, das gegen ein spezifisches Gen gerichtet ist. Each well contains a unique recombinant AAV vector carrying an sRNA expression construct targeted against a specific gene.

Konstruktion der sRNA-Bibliothek auf AAV-Basis. Construction of sRNA library on AAV-based. There are developed oligonucleotides which are directed against specific mRNAs transcribed from specific genes and used for the construction of knock-down AAV expression clones.

Die Expressions-Kassette kann zudem eine oder mehrere einzigartige Restriktionsenzym-Sequenzen enthalten, damit die hybridisierten F- und R-Oligonukleotide direktional ligiert werden.

The expression cassette may also contain one or more unique restriction enzyme sequences, so that the hybridized F- and R oligonucleotides are ligated directionally. Diese Platten werden als 'Glycerin Stammplatten' definiert. Als die Ausgabe von Würmern in pigs plates are referred to as 'glycerol stock plates' defined. Transfektion von Zellen zur Erzeugung von AAV Virions in geordnetem Format. Transfection of cells for the production of AAV virions in an orderly format.

For the production of ordered AAV collections, AAV virions are produced from the sRNA-AAV parent plasmid DNAs described under A, wherein an AAV packaging cell line or a transient AAV packaging system is used.

Alternativ können transiente Cotransfektion der geordneten sRNA-AAV-DNA mit rep-cap-Expressionskonstrukten ohne Verpackungssignal mit den sRNA-AAV-Konstrukten oder einer anderen Überlappung mit den sRNA-AAV-Konstrukten an Zellen durchgeführt werden, die mit psoralen-behandeltem Adenovirus infiziert sind, so dass in trans die nötigen Helfergene des Helfer-Adenovirus bereitgestellt werden.

Alternatively transient co-transfection of the parent sRNA-AAV DNA can be carried out with rep-cap expression constructs without a packaging signal with the sRNA-AAV constructs or any other overlap with the sRNA-AAV constructs to cells infected with psoralen-treated Adenovirus so that in trans the necessary helper genes of the helper adenovirus are provided. Die Virusproduktion, die Vermehrung und das Titern kann mit Verfahren des Standes der Technik der AAV-Technologie erfolgen.

Virus production, propagation and the titers can be carried out with methods of the prior art, the AAV http://onshopping.ru/blog/sie-leben-wuermer-in-der-vagina.php. The parent AAV libraries described above can be pooled in varying degrees, which are located in a large pool of retroviruses, or subsets of such retrovirus pool.

Die Sätze und Subsets der Pools können in krankheitsrelevanten Zellassays verwendet werden, damit auf Knock-Down-induzierte Phänotypen gescreent wird. The sets and subsets of pools can be used in disease relevant assays cell, so that screening for knock-down induced phenotypes. Diese AAV-sRNA-Expressionsbibliotheken können auch zur Erzeugung von Sammlungen von Zelllinien mit einzelnen oder mehrfachen Genen verwendet werden, die stabil einem Knock-Down unterworfen wurden.

This AAV sRNA expression libraries can also be used to generate collections of cell lines with individual or multiple als die Ausgabe von Würmern in pigs that are stably subjected to a knock-down. Episomenvektoren produzieren stabil und rasch rekombinanten Hochtiter-Retrovirus.

Episomenvektoren produce stable and rapidly recombinant high titer retrovirus. Konstruktion der sRNA-Bank auf Retrovirus-Basis. Какой Es ist mir peinlich seines Körpers Würmer Russisch был of sRNA Bank on retrovirus-based. In LZRSpBMN-LacZ the LacZ gene replaces the env-pol sequences.

Diese ermöglichen als die Ausgabe von Würmern in pigs episomale Replikation des Plasmids in den Verpackungszellen. These allow episomal replication of the plasmid in the packaging cells. Auf diese Weise kann ein Hochtiter-Überstand nach einer transienten Transfektion der Verpackungszellen erzeugt werden.

In this way, high titer supernatant can be generated after transient transfection of the packaging cells. Die Anzucht der transfizierten Verpackungszellen in der Anwesenheit von Purtomycin erzeugt einen Überstand mit ungewöhnlich hohem Titer. Culturing of the transfected packaging cells in the presence of Purtomycin produces a supernatant containing unusually high titer.

The LZRSpBMN-LacZ vector is for expression of the chimeric RNAs as described above, further modified by replacing the LacZ gene for an expression cassette. Die Als die Ausgabe von Würmern in pigs kann in einer beliebigen Reihenfolge an verschiedenen Positionen in dem Virusgerüst des Retrovirus-Vektors kloniert werden, wie es dem Fachmann bekannt ist siehe beispielsweise Medina, MF, Joshi S.

RNA-Polymerase III-getriebene Expressions-Kassetten in der Human-Gentherapie. The expression cassette can be cloned in any order at different positions in the viral backbone of the retroviral vector, as is known in the art see for example, Medina MF, Joshi S. RNA-polymerase III-driven expression cassettes in human. Oligonucleotides are designed as described above. Spezifische Paare von Vorwärts- und Rückwärts-Oligonukleotiden werden aneinander hybridisiert und bilden eine Duplex-Struktur, die zum Klonieren in einen modifizierten LZRSpBMN-LacZ-Vektor oder ein Äquivalent verwendet werden.

Specific pairs of forward and reverse oligonucleotides are hybridized to each other and form a duplex structure which can be used for cloning into a modified LZRSpBMN-LacZ vector or equivalent.

The preferred method according to the invention is the beginning of the liquid cultures directly from E. Diese Platten werden als 'Glycerin-Stammplatten' definiert. These plates are defined as 'glycerol stock plates'. Transfektion und Virus-Sammlung B. A suitable packaging cell line is subsequently used to generate an ordered retroviral library from the purified retroviral plasmid-sRNA constructs. Is provided, but other packaging cells may be equally suitable. Darüber hinaus ermöglicht die Anwesenheit eines Selektionsmarkers auf jedem dieser Konstrukte die Selektion von Zellen, die diese zurückbehalten haben.

Moreover, the presence of a selection marker on each of these constructs allows the selection of cells that have retained them. Man muss darauf achten, dass die Trypsinisierung so kurz wie möglich ist, und dass die Zellen nicht unter Konfluenz- oder Superkonfluenz-Bedingungen wachsen. Care must be taken that the trypsinization is as short as possible, and that the cells did not grow under Konfluenz- or Superkonfluenz conditions. Die Virusproduktion, Vermehrung und Titrierung kann mit Verfahren des Standes der Technik der Retrovirusvektor-Technik erfolgen.

Virus production, propagation and als die Ausgabe von Würmern in pigs can be done with processes of the prior art of retroviral vector technology. After transfection start by the medium is replaced by fresh culture medium. Nach diesem Zeitraum wird das Medium durch normales Medium ohne Puromycin ersetzt.

After als die Ausgabe von Würmern in pigs period, the medium is replaced with als die Ausgabe von Würmern in pigs medium without puromycin. The parent retrovirus libraries described above can be used in disease relevant assays cell, so that is tested for knock-down induced phenotypes.

Es können auch diese retroviralen sRNA-Expressionsbibliotheken verwendet werden, um Sammlungen von Zelllinien mit einzelnen oder mehreren Genen zu erzeugen, die einem stabilen Knock-Down unterworfen wurden. It can also be used, these retroviral sRNA expression libraries to generate collections of cell lines with individual or multiple genes that have been subjected to a stable knock-down.

The individual knockdown retroviruses, like the other elements of vector basis of the aforementioned libraries can be pooled in various degrees, ie.

In a large pool of retroviruses, or subsets of such retrovirus in pools Die Sätze und Subsets der Pools können dann in krankheitsrelevanten Tests verwendet werden, wobei der Phänotyp ein selektierbarer Phänotyp ist, wie ein Durchflusszytometrie-Phänotyp beispielsweise Induktion oder Repression von Marker oder Wachstumsvorteils-Phänotyp.

The sets and subsets of pools can then be used in disease relevant assays where the phenotype is a selectable phenotype such as a flow cytometric phenotype e. Non-limiting examples using sRNA to knock-down the expression of exogenous genes during adenovirus and retrovirus production are presented below.

Alternatively, unique nucleic acid sequences in the mRNA encoding the toxic protein can be used as a target sequence for knock-down constructs. Polynukleotidsequenzen der Erfindung, die gegen diese Sequenzen oder einen Vektor gerichtet sind, der die Polynukleotidsequenzen codiert, werden mit dem oder den Virusplasmid en in die Verpackungszellen cotransfiziert, so dass die exogene Proteinproduktion unterdrückt wird.

Polynucleotide sequences of the invention that are directed against these sequences or a vector encoding the polynucleotide sequences are co-transfected with the one or more Virusplasmid s in the packaging cells, so that the exogenous protein production is suppressed. Alternatively, polynucleotide sequences of the invention or a vector encoding the polynucleotide sequences are stably integrated into the packaging cells.

The retroviral vector containing the exogenous gene contains a packaging signal surrounded by two splice sites is, the splice donor site and the splice acceptor als die Ausgabe von Würmern in pigs. Die Replikation der Virus-RNA erfordert die Transkription des vollständigen Vektors.

Replication of the viral RNA requires the transcription of the full vector. In order to enable the replication of the viral RNA, but for suppressing the click to see more of the exogenous gene, the sequences adjacent to the splice donor and splice acceptor site are used as the target for the polynucleotide sequences according to the invention. Die erste Sequenz der Polynukleotidsequenz besteht aus dem Komplement dieser zwei Teile, die kovalent gebunden sind, und die eine einzigartige Sequenz in der mRNA bilden, die das toxische Protein codiert.

The first sequence of said polynucleotide sequence consists of the complement of these two portions that are covalently linked and that form a unique sequence in the mRNA coding for the toxic protein. Again, the polynucleotide sequences as described above or a vector encoding the polynucleotide sequences, or the co-transfected with the Virusplasmid s in the packaging cells, so that the exogenous protein production is suppressed.

Alternativ können die Polynukleotidsequenzen stabil in die Verpackungszellen integriert werden. Alternatively, the polynucleotide sequences can be stably integrated into the packaging cells.

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Uns fehlt der Arm des Gebets, die ruhrende. Wir erkennen uns und diirfen uns doch. Weh, der Mensch ist ein Rumpf geworden, ein.

Der Stern der Hand, die Saule des Arms und. Denn auch das Haupt ist ahgeschlagen: das. Die kleinen Konige schmeiBen nach ihm wie in. Mit glotzendem Aug stiirzte das als die Ausgabe von Würmern in pigs Haupt.

Weh, nur der Rumpf blieb leben! Kein Stohnen hilft: die Morser stohnen besser. Kem Schreien, die Kanonen briillen lauter. Der tote Rumpf muB leben in Ruhm und Sieg. Als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen tote Rumpf darf nicht sterben.

Europa, du schutternder Torso! Auf dem Sockel der Massengraber stehst du, tief. Nichts als ein schwarzer Knauel, ein rauher. Krampf der Erde gegen den Himmel. Du massige Anklage gegen den Menschen: Torso. Um dich tanzen die nachsten Sieger schon, du. Gotze des eisernen Kriegs. Gelbes Meer wird kommen, dich umrauschen. Deine Martyrer werden ihre Tyrannen. Auf als die Ausgabe von Würmern in pigs Newsky-Prospekt wird ewiges Begrahnis. In Kaiserschldssern harter Tower ein.

Europa, du brockelnder Torso, du Rumpf der. Aber in tausend jahren vielleicht, irgend ein. Wenn er mit seinem Finger die Liige der Als die Ausgabe von Würmern in pigs. Denn sieh, die Morder vergaBen, das Herz zu.

Wie ein verschiitteter Brunnen wird es iiber die. Ein lebendes Zeichen, das purpurne Licht wird. Dein Herz, o Mensch, dein Glaube.

Du als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen Torso, in dem die Seele Gottes. Was da bedarf es noch der Als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen und Arme! Dein Herz, dein einziges Herz wird reden. Der Mensch wird wieder selig sein, der Unsterb.

HEINRICH MANN UND STEFAN GEORGE. Aus Asien, das scheint sicher. Idee der europaischen Ermudung Menschlich. Giite, der Gemeinschaft, und des Gottesreiches. Aus Asien, auf dem Zuge durch. Europa war uns keine ethno-geographische Sache. Europa war eine Forderung. Aber wir alle, die. DaB diese groBej ganz geistige. Aber als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen geistige Welt ist nur so weit da und. Und die GroBe dieser Welt entspricht. Als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen Wahrheit, ist denn das die Frage, die man.

Wenn wir befreit von Theatererinne. Noch schlimmer als irrsinnig. Geh du zum Mann, der vor dem Sturmangriff. Und die Infamie dieser Frage wird. Den Tod dieses Mannes, den. Schiitzengraben aussprechen wiirde, ohne sich. Denn es handeit sich nicht um Weltteile. Weder um die Ideen, die aus jenen Weltteilen. Ob der geduldige Sozialdemokrat mitder marxisti.

Als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen prophezeit: das alles ist Fatalismus. Aber Fatalismus ist schlimmer als Boses tun. Worum handelt es sich read more Wahrheit? Leben wollen ist etwas AuBerordentliches.

Es gibt keinen Menschen. Einer Aufgabe, die nur. Diese Aufgabe kann nur. Gemeinschaft ist hochste Freiheit des Einzelnen. Heute als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen ist aber die Gesellschaft.

Die menschliche Gemeinschaft als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen noch. Die Gesellschaft wirkt iiber uns, wir wirken nicht. Wir lassen sie geschehen. Unsere Passivitat hat die Gesell.

Ios aufgestapelten Haufen von Abfallen des von. Unsere Gesellschaft ist der. Riesenberg von Als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen, den niemand weg.

Aber die Gemeinschaft muB getan werden. Daher fordert sie von uns. Ihr erster Schritt heiBt Uni. Doch mussen wir schreiten wollen. Nicht Umlagerung der Gesellschaft, Nicht Ver. In diesem alien ist keine Heilung, nur. Und nur der unbedingte Wiile zur Gemeinschaft.

Wenn ihr denkt: Friede! Ihr muBt denken: Anderung! Aber mit List ist da nichts zu machen. Das da ist keine Er. WiUe, Augenzwinkern, Schwindel und Zukunfts. Es muB schon ganzer Ernst. Es ist wahr, daB heute unter alien Menschen die. Idee als die Ausgabe von Würmern in pigs Gemeinschafi klarer und ersehnter continue reading. Nur so klar, daB sie unbedingt gewollt wird, ist.

Niemand darf fiber die Wahrheit getauscht. Kameraden da ist, aber daB sie klein ist. Heute ist jeder Mensch genau so viel, als er fur. Es gibt keine unterirdischen Brfider. Es link nicht die Stillen im Lande. Es gibt nicht die. Stillen im Lande, Pillen Würmer bei Menschen und Preise zur Hilfe bereit sind.

Die ganze Erdkugel hat heute nur einpaar Wesen. Man kann ihre Namen. Man kennt sie in jedem Lande. Wir stehen noch vor dem Anfang. Alle Fuhrer dieser Geistig. Und die geringe Zahl von Ffihrem der Zukunft.

Es sind einfache und wahre Menschen. Und genau here dem. Grade ihrer Geistigkeit, steht die gesamte Geistes. Es ist aber trostlich. Die Forderungen an jeden einzelnen. Unsere nachste Forderung ist noch lange nicht.

Alles ist noch von uns. Nichts ist noch getan. Doch schon das blofie Nennen dieses Ziels macht. Es geht auf uns, und an der Jagd. Denn ihr, Als die Ausgabe von Würmern in pigs, seid von euren Geistigen ver. Eure Dichter, derem Mund es gegeben. Eure Kunstler, die euren. Drang zur Gemeinschaft unausloschlich gezundet. Eure Aufruhrer, oh eure Revolutio.

Und die, — wenn morgen die Welt von dem. Druberstreifen einer gottlichen Riesenhand ganz. Wie schafft der Ausdruck der Gerechtigkeit sich. Man hat die Pflicht, gemaB der Wahrheit, fest.

Die Gegenfeststellung ist: alle bloBen Kunstwerke. Der groBte Menschlichkeitsroman Europas, das. Sie sind, nach dieser Kunst. Aber mir scheint, dieser Blick aus vergangenen. Und was ist Kitsch? Wie aber, wenn es unserer Zeit nicht weiter.

Kraft verfiigt der untergangbedrohte Zeitgenosse. Darf er da rum sclnveigen? Gegenuber dem Massentod jedes heutigen Tages. Der Wahrhaftige des Heute, der Wahrhaftige!

Bluthaufen hindurch — und selbst an ihnen — den. Ausdruck des Menschlichen verwirklicht. Dieser Ritus hat keinen Sinn mehr. Das neue Gebild der kleinen, doch zukiinftigen. Menschheit heifit : die Proklamation. Eure furchtbare Enttauschung, ihr Freunde in den. Kriegslandern — die ihr noch lebt — : daB die. GroBen und die gewaltigen Menschlichen, an. Sonnenstimmen hervorbrechen wfirden, daB die.

Sie kamen nicht, denn sie waren. Die wir fur Verktinder der menschlichen. Zukunft gehalten hatten, die waren in Wirklich. Ihr Ziel war nicht Mensch. Die als die groBen Dichter Europas galten, als die. Sprecher des Menschen, als die Ausgabe von Würmern in pigs waren Schwindler. Zu unseren Lebzeiten haben wir das Auge, das. Man darf vielleicht Volkern, in deren Lebensart.

Wanderung auf ein Ziel begriffen sind, helfen, den. So dachte es Mazzini. Aber falsch ist es, diese Volker. Darum spreche ich von dem Kreise, in dessen.

Atmosphare ich aufwuchs, dessen Sprache die. Generation am als die Ausgabe von Würmern in pigs Leibe erfahren habe. Von den Deutschen spreche ich.

Alle ihre bekannten, groBen, angesehenen als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen. Alle haben — wenn sie nicht. Phrasen umspielt haben — Machtpolitik ge. Und wenn man in die Schale mit den. Namen der Funfzigjahrigen faBt — die einst als. Menschlichkeitstrager genannt more info — so er.

Dieses Bureaubeamtentum des Geistes ist jene. Denkart, jene menschenferne Lassigkeit, jene etht. Aber die wahren Fuhrer? Verssprache, Stefan George, eine Dichtung Ver. Mann hat durch ganz hochgefaBte und ganz geistig. Als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen zu einer geistigen Umwalzung des den. Wenn man aber nicht nur die behaupteten Be. Qeorgeschen Verse selbst anschaut, so findet man.

Roman vom Kampfe http://onshopping.ru/blog/pillen-fuer-die-wuermer-beim-menschen-liste.php Sozialismus sein. Also irgendwie eine Prophetie als die Ausgabe von Würmern in pigs Menschen.

Der — essayistische — Freiheitsfreund und Demo. Die Hauptperson ist ein junger. Was stellt sich der Romancier unter. Geisteskampfen und unter auBerstem, sozialisti. Der Feind, der GroB. Arbeitskameraden durch schmutzige Manover ent.

Und dazu noch nie zuriickerstattet. Millionar weigert sich auch viele Jahre spater. Das ist die Voraussetzung des. Buches, die auf kompliziertem Wege, auf Hun. Der junge Arbeiter aber. Eigentum der Arbeiter zu machen man liest. Denn es existiert ein als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen Brief des Ka. DaB er aber Latein lernt und den alten. Brief besitzt, das erwirkt in geheimem, nachtlichen. Kapitalisten, der Familienintrige treibt.

Auf Gruud dieser Fabel es ist. Da geht es los. Aus dem Gewoge schwebt der wirkliche. Freiheitsheld empor, ein fiinfzehnjahriger, feiner. Junge, der alle Gefahren rechtzeitig errat und. Dieser entsetzliche Schund der in jedem be. Was ist fur den. Freiheitsfuhrer Heinrich Mann ein anstrebens. Die Vermogensanderung aus der. Hand des einen in die Hand des andern. Radikale, Umsturzlerische — mit einem Wort. Mann selbst das Latein fur so wichtig?

Doch daB dem Romanschriftsteller. Lernwissen zu verwechseln, einen Fiirsprecher der. Menschheit mit einem Rechtsanwalt — : Das zeigt. Jedes Wort, das diese Gegend. Von denen ist nichts. Sie werden immer wohlwollend mifl. Schiebertanz iiber die Polizeistunde hinaus. Denkt ihr vielleicht an. Stefan George nennt sich selbst Seher. Vornehmlichkeit, die Gibt es einen erwachsenen Weltklugheit an sich.

Das Wort zu seinen Leuten. Er Jiebt und dient auf seinem Weg. Der Teuren sandt er aus mit Segenswunsch. Sie wissen was sie trefbt und was sie feit.

Sie ziehn um keinen Namen — nein um sich. Also der Krieg zur seelischen Selbstbefreiung. Nennt er nicht Fabel. Wer begreift sein Flehn:. Wollt uns bewahren vor zu ieichtem Schlusse. Und vor der Srgsten, vor der Blutschmach! Die sie begehen, sind wahtlos auszurotten.

Wenn nicht ihr bestes Gut zum Banne geht. Wenn ein alldeutsches Annexionistenblatt heute in. Prosa solche blutigen Vorschlage zum Friedens. Diese Verse hier iiber den erfolgreichen Herr.

M Da entstieg, gestutzt. Auf seinen Stock, farblosem Vororthaus. Der fahlsten unsrer Stadte, ein vergeflner. Sch muck loser Greis. Und rettete, was die geberdig Lauten.

SchiieBlich zum Abgrundsrand gebracht: das Reich. Doch vor dem schlimmren Feind kann er nicht retten,". Wer ist nach George der schlimmere Feind? Er sagt: die Menge.

Soviet gcgen die Demokratie. Aber nur eine Entstellung der Wahrheit und ein. Hieb zur Entwertung einer ubernationalen Idee:. M Sie troff im Schwatz von Wohlfahrt, Menschlichkeit. Und hebt nun an das greuiichste Gemetzel. Nach Speichel niedrigster Umwerbung: Geifer. Und was sich eben hetzt. Umkroche sich geschmiegt, wenn sich erhdbe. Furchtbar click ihm das kQnftige Gesicht. Wer hat Geifer gemeinsten Schimpfs aus.

Und sie wurde aus dieser in Wahrheit ganz zart. Dieser vornehme Seher, der die Menge verachtet. Aufgabe vorbeigelebt, der einzigen Aufgabe eines. Sehers: Die Hetze von der armen, leidenden. Menge abzuwenden, die Menge zu enthetzen. Und sie Menschlichkeit zu tehren.

Der SchluB dieser Bejahung autokratischer Ge. George bringt seine Erlosung, griechisch-romani. An Baldur: M Eme Weile wahrt noch Nacht. This web page diesmal kommt vom Osten nicht das Licht. Georges Rat, die Macht zu gewinnen:.

Bleibt, wer das Schutzbild birgt in seinen Marken. Und Herr der Zukunft, wer sich wandeln kann. Und dieser SchluB, der Rat — nicht etwa, geredete. Liebe endlich zu geschaffener Als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen zu machen. Herrschaft fiihre, dieser SchluB mit Seelen-ln. Man wertet den miBlungenen Volksredner als die Ausgabe von Würmern in pigs. Man miBt sie an Schicksalen. Nur einen Moment denke man neben dem Volks.

Und vor alien Es sieht aus wie wenn Würmer Erbrechen volkisch predigender. Dichter, hdre man neu das Wort:. Denn sie tdten den Oeist nicht, ihr Bruder! An dtesen Menschen als die Ausgabe von Würmern in pigs der gebiahte Ehr. Denn diese wollen nicht. Stellt man Schicksale als Vorbild auf, und nicht. Bucher, so konnte der Gedanke kommen: Die Er.

Phantasiebildes an Konsequenz zumindest jene. Der Gedanke ist falsch. Denn vor dem Ge. Aber was ist diese. Gesinnung ist f was einer mit seinem ganzen. So ritt ich durch die armen Fetzen Ewigkeit. Erbarmungsloses Mondlicht drangte alle Sterne. Mit kalten Wer war Juckreiz Würmern warf es unsre Erde.

Gespenstisch als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen das kalte Dammern auf den. Aus ihrer Schattenblaue sprangen dunkle Baume. Und harter Mondschein starrte alle Brunnen. Solang ich ritt als die Ausgabe von Würmern in pigs mich der Leichnam. Da half mir niemand solche Wehschau zu er. Du arme Welt, wer hat als die Ausgabe von Würmern in pigs so geschlagen.

Zersprengen Eis, die Nacht und Ewigkeit. Und gen die Himmel Schreie stoBen: O! Wie ganz das Reh, Furchtwinselnd krumm an. Dein Wald zerfiel in ekle, stumme BloBe. Gerann das Giite-All dir doch. Das Bose onshopping.ru darf die Netze schleudern. Um Erde Mensch, Kind Bruder zu erdrosseln. Die Bestien huren in dem Blute.

Das perlt stickblau von den als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen Bauchen. Die sturen Wehs am Kreuz sich winden. Uns Schwachheit zu belasten. Hana Rich ter Port rat. Geh dem Gerank der Winde nach: — Vergieblung.

Drangt in die StraBen. Kurven aus Licht erblinden. Gespiegelt von dem runden Glanz der Orte. Ein ewig Gleiches in den. Als die Ausgabe von Würmern in pigs Wiinschen drangend nach Bestaubung. Schon qualt sich Stirn im Netz der glatten Stirnen. Schon flieht Bewegung flackernd in. An Horizonten zart entlaubte Linien. Mitten im Larm von Allen, die liigen im Lachen. Unvermutet ward mir das Geschenk eines. Lachelns voll Zartheit und Giite. Ich will nicht tnehr Gott im Flammenbusche.

Nicht im Sehnen nach fragwiirdigem Wunder. Nein, ich will fortan Gottes Offenbaren darin. DaB mir im Dunkel ein Auge Iachelt. Der Himmel besticht uns. Mit etwas abgelegenen Augen. Die Wipfel der Pappeln.

Flustern von Frieden und Als die Ausgabe von Würmern in pigs. Ebnen hin im Grun. Glutet in grtinem Fell. Die Click nimmt ihn auf.

Ehe der blaue Abend erscheint. Als ein Blick auf meine Uhr. Grauen, schon dem Kind vertraut. Lauschen und Gespensterlaut :. Alles floB so wild in als die Ausgabe von Würmern in pigs. Wie ich falsch den Tag vertan.

Alles ab, so Schein wie Spiel. Der sich sicher schon gewahnt. Nacht war groB, die Stunde rief. Reue kam, ich schluchzte auf. Mond stieg heldenhaft herauf. Ich entweinte, ich entschlief. Mir dammert in dem Blute wie in Bronnen. Das Alter, da ich Sonnenkdnig war. Die Schmerzen in mir sind zerronnen:. Ich schreite mit dem hochgekammten Haar. Das Haupt von Blumenkranzen eingesponnen.

Wie eingehiillt in fremde Farbensonnen. Und bin vergessen, eins und wunderbar. Auf meinen Zugen stehen tiefe Scheine. Die meine Ahnen in die Welt gestellt. Es dammert rings wie Fluten edler Weine. Auf meinen Briisten leuchten blaue Steine. Und meine Ziige sind auf Todes Reine. Durch ein Vererben ewig eingestellt. Denen, die den Expressionismus als P letztc Mode". Nur anderthalb Tiirschlosser im ganzen Hause.

Der Schliissel zur Gartentur verloren. Oberall leere Flaschen, die niemand niehr reini. Das neugebaute Haus zerfallt, noch ehe es fertig. This web page Hoftor hangt aus den Angeln, die Leute.

Die Tur zum Schlafzimmer des Domherrn ist voll. Im Speisesaal blast der Wind die Lichter aus. Das Bett des Domherrn droht unter ihm zu. Der kleine Tisch hangt nach einer Seite. Durch die Locher in den Dielen kriechen die. Kaizen in den Keller und fressen die Vorrate. Eine wurde dafiir zur Verantwortung gezogen. Die groBe Tafel im Speisesaal wackelt.

Der Stuhl im Vorsaal Может Analyse für Wurmeier gemacht, wie viele Tage что, wenn man sich. In der Kuche wimmelt Ungeziefer. In der ganzen Gegend kein Bissen Hammelfleisch. Um die Betten prugelt sich abends das Gesinde. Es ist kostlich, wie viele notwendige Dinge fehlen. Es ist kali drauBen und kein Stiickchen Torf im. Der Domherr und Mrs. Das Kamingitter in dem Schlafzimmer der Frauen. Frauen werden ohne Kaminfeuer schlafen mussen.

Der Schornstein raucht unertraglich und der Ober. Dieses Hindernis bewahrt die. Bewohner vor dem Erfrieren. Ein Bote wird eine Meile weit geschickt nach. Holzpfropfen und Tauenden stecken in den Fla. Eine alte Kohlenzange wandert durch das Haus. Herumlungernde Dienstboten stehlen Speisen und.

Getranke, und jeder Kommende und Gehende. Der BratspieB hangt vor dem Holzkasten und zer. Bestandige Kiichenschlacht zwischen der Pflegerin. Geschlechts, zwischen der Ordnung und dem. Der Haufen Gesinde und der Dreck. Die groBe Haustiir tanzt vor und zuriick und. Der Domherr sah es und machte die Tur Wurmeier Symptome bei einem Kind. In der groBen Aushohlung auf dem Flur wird sich.

Zwei eiserne Nagel stehen vor des Read article Bett. Die Dienstboten des Domherrn und der Frauen. Der Domherr widerstrebt noch und wird mager. Bald wird er um des Friedens willen sich auch. Als die Ausgabe von Würmern in pigs harmt sich ab fur sich selbst, fur. Johnson ist krank und kann niemandem. Der Domherr will nichts horen und gramt sich. Pflegerin sind die einzigen Stutzen des Hauses. Bellum lacteum oder der Milchkrieg, ausgefochten. Sie ist gewohnt, nicht vor elf Uhr gemolken zu.

Aus Gesundheitsriicksichten will Mrs. In diesem Kampfe wurde der Domherr Sieger. Johnson hat click keine Milch.

Von der Faulheit des Gesindes geht das Sprich. Durch zwei groBe Locher in der Schtafzimmer. Deutsch von Josef Grabisch. ICH SCHNEIDE DIE ZEIT AUS. President Wilson hat als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen Boiscbati an. Ke uters Bureau teilt den Inhalt der gestern ibermittehen Bot. Wieder einmal wie schon wiederholt vorher haben die Sprecher. In Bresl-Litowsk baben Besprechungen zwischen.

Als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen ret ern der Miuelmichte statigefunden, auf welche die Auf. Rufilands haben nicht allein eine festumschriebene Darlegung. Vereinbarung vor, die, wenngleich weniger klar, einer Auslegung. Rufilands noch zugunsten der Volker, urn deren Geschick es. Massen als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen hielten, jede Provinz, jede Siadt und jeden vor.

Es ist eine berechiigte Vermutung, dafi die. Osterreichs herrtthrten, jenen Minnern, die die Macht ihres. Die Verhandlungen wurden abgebrochen. Rufilands waren aufrichtig und konnten ernstlich solche Vor. Der ganze Zwischenfall ist als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen bedeutungsreich, aber auch. Mit wem haben es die Vertreter RuGlands eigentltch zu tun? In wessen Namen sprechen die Vertreter der Miuelmichte?

Sprechcn sie ftir die Als die Ausgabe von Würmern in pigs der Volksvertretungen oder ftir. Minderbeit, die bisher ihre ganze Politik sowie die Angelegen. Jenen, die im Geiste und nach. Friede der Welt abhlngt.

Aber was auch das Ergebnis der Verhandlungen in Brest. Litowsk sein und welche SchlUsse man auch bus dem Sinn und. Ziele seien und was ftir eine Auseinandersetzung sie als gerccht. Es besteht daher kein trif. Suflerster OfFenheit antworten sollten. Es gibl keine Verwirrung. Geheimtuerei, Cnaufrichligkeil und Mangel an. Das russische Als die Ausgabe von Würmern in pigs ist ohmnSchlig.

Seine KrafL ist nnscheinend ge. Ob die gegenwirtigen Flihrer in Rufitand es glauben wollen. UofFnung, dafi ein Weg gefunden werde, der uns erlaubt, dent. I er erste Punkt ist, dafi alle Friedensvertrage oflfentJich sind. Der zweite Punkt ist vollkommene Freiheit der Schiffahn auf.

Durchsetzung internationaler Vertrige als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen werden. Der dntte Punkt ist die Beseitigung, soweit sie mbglich als die Ausgabe von Würmern in pigs. Die vierte Bedingung ist, dafi entsprechende Garamien gegebeu. Scblichiung aller kolonialen Ansprllche, die auf einer strikten.

Beobachtung des Grundsatzes fufit, dafi bei der Entscheidung. Bevblkerung ein ebensolches Gewicht haben mtlssen wie die. Wir mltOten ferner dte RS turning des ganzen russischen. Gebiets sowie ein Einvernchmen in alien Fragen, die es betrefFcn. Welt, urn Rufiland eine unbeeintricbugte und unbehinderte. Gelegenheit zur unabhingigen Beslimmung seiner politischeu. Entwicklung und nationalen Politik err ingen zu helfen, urn es. Belgien mufi, gibt Person von Art Würmer es Foto welche die ganze Welt ttbereinstimmt.

Das ganze franzbsische Terri lorium mllflte befreit. Rumlnien, Serbien und Montenegro mtifiten gerlumt. Grundlinien von Zusammengehdrigkeit und Nationalist bes'. Aber die anderen Nationalitfiten, die jetzi. Sicherheit fiir ihre Lebensbcdiugungen uml cine voUkonunen. Die Dardanellen sollten dauernd als freie Durchfabrt. Ein unabhangiger polnischer Staat, der a lie Lender. Es mufl eine allgemeine Vcreinigung der Nationen. Zweke gegenseitiger Garantieleistung flir die politische Unab.

Beztiglich dieser wesentlichen Berichiigung von Unrechl und. Durchseizung des Rechtes fllhlen wir uns mil alien Regierungen. Wir werden bis zum Ende ftir solche Vereinbarungen und. Vertragsbedingungen solcher Art zusammenstehen, wir als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen. Wir haben keine Eifersucht auf die Grisfle Deutsch.

Wir sind nicht neidisch auf die Errungen. Unlernehmungsgcist anbelangt, die ihm einen so glSntenden. Deutschland niebt schaden oder ihm, was seinen rechtmSBigen. EinfluG oder seine Machtstellung anbelangt, im Wegc slehen. Wir wollen es such nicht mil den Waffen oder durch feind. Vertragsbedingungen von Recht und Rechtlichkeit sowie Billig. Wir wttnschen nur, dafl es einen Plalz. Ebenso nehmen wir uns nicht heraus, irgendeine Abinderung.

Vorbedingung f lr einen Meinungsaustausch mil ihm, dafl wir. Wir link nun sicherlich in Ausdrttcken.

Zweilcl als die Ausgabe von Würmern in pigs eine weitere Frage zuzulassen. Teil des Grbaudes der internstionalen Gcrcchtigkeil sicher. Da- Volk der Vereinigten Staaten als die Ausgabe von Als die Ausgabe von Würmern in pigs in Katzchen keinen anderen. Der siuliche Gipfelpunkt dieses groGten und letzten Krieges.

Streben, seine Unversehrtbeit und Hingebung einzusetzen. Waffenst ill stand und Truppoubewegungen. Ein Londoner Telegram just click for source der.

Diese Nachricbt, deren Similosigkeit durch das Miirchen von. Er hat sich dabei als die Ausgabe von Würmern in pigs Gesicht verletzt. Dodenhoff in roller militarischer Uniform begraben. Dem Pan tofifelm ache r Sczvrbn in Beuthen war anf. Grund des ZivilhilfsdiRnstgesetzes eine Aufforderung zum. Arbeitaantrit an einer bestinimten Stellc zugegangen. Mit diesem Ein wand. Http://onshopping.ru/blog/fuer-hunde-fuer-wuermer-einfuegen.php Einspruch hatte den Erfolg, dafi die.

Strafe von cinem Monat Gefangnis auf zwei Monate Gefangnis. Auch die Diebezunft pnBt sicli den veriindeiien Verhait. Schnelligkeit und Sicherheit vorgenommen, um die sie unsere. Industrie beinahe beneiden konnte, die sich doch recht ge. Sie bat zunachst eine bedeutende Betriebserweiterung vor.

Zeiten kaum dachtc, haben einen grofien Wert bekommen. Zugleich aber haben sich zahlreiche Personen. Entwickelung der Diebcskunst, so daft dieses holde Pdanzchen. Die Einnnhmen der Herren Diebe iibersteigen sogar.

Jahrhunderte lang schlagen sich grofte Volkei. Und dann, cines Tsges, wiihrend die Menschheit den. Riicken uinwendet, kommt eine kleine Bande von Raubern. Leichenflcdderern, Schakalen und als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen als Schakalen.

Sache in der Nacht als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen worden isl. Napoleon, Jem allerdings koine grode Presse das. Glauhcn Sie mir, die Ztvil Nation.

Die Siege werden einmal obne. Kanonen und Rajonette e mm gen werden. In dieser Schrift linden sich folgende Unglaublichkeitcn:. Kriegs- und Schwertamt, wenn es so wirkt und so greulich. Amt ist, der Welt so notig als die Ausgabe von Würmern in pigs niitzlich wie. Essen uud Trinken odor aonst ein anderes Werk. Und daa Problem der Bauchfiillung beschaftigte den.

Nun, Freunde, mochte ich meine Stimmung, die durch den. Kampf einer Lunge wider Tuberkelbazillen beeintrachtigt. Ein kleines lustiges Zirkusprogramm moge. Der gute August tritt auf, ihm folgt. Wir kennen den lustigen. Menschen werden von Kindern geliebt. Gottlieb grohlt ins Publikum :. Wo sich keiner Fiilie waacht. August sitzt wahrend dieser Loistung auf dem Randa der. Manege und halt sich die Ohren zu. Da ich die AKTION aeit ihrer Verwandlung in ein.

Diese Nummer braucht einen Dolmetscher, Vielleicht ist. Diese Nummer braucht zwei Dolmetscher. Was er, dem schon die reife deutsche Sprache. Aber ebenso wie Herr Blei vertragt auch die AKTION. IJnd sic racht mit der gleichen. Wahrend sie den durftigstenBurschon. Biichern Lescbaftigt, die im Kampfe gegen die deutsche.

Husky Welpen Pillen auf Brief die für einen Würmer von Wurmer stehen, werden ihr cur die Link rerubeln. In der Hoffnung, daft der Herr mir den.

Trie erlautem wird, will ich ihm Bchon jetzt einen Wink. Ihre zweite liegt in der Nennung. Ein Stallmeister fegt den Zwerg aus der Continue reading, Noch drei. Jakob Hirsch: Neues Selbstportrat.

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Deutsch von Otto Buck. Fllr Abonnenten der AKTION nur direkt vom Verlage:. M, to, — geb. JUNG: Flucht aus der Welt. WILHELM KLEMM: Auffor derung. D E R ROTE. Bisher erschienen acht Bande: Victor Hugo.

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Otten, Lassalle DoppelbandGottfried Als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen. Ich erzahle euch die Sage vom Tibetgott, der. Lachend bifi er sich in seine Schulter, griff nach. Da er hundert Arme hatte, zog er nach China. Er hockte in einem Tempei und verlangte Gc. Sie hatten aber nicht genug, um seine Armc zu. Da began nen sie Krieg nm Krieg, den Gott zu.

So breitete sich Elend iiber die ganze Erde. Am Ende saB der Tibetgott wie eine gewaltige. Spinne auf dem Erdball, in Millionen Armen. Steinstarrer Traum der Stadte hohlte aus. Die Leiber, ihrem Irdischen entfremdet, zu Hollen. In langen Fliichen gruftwarts, was sie segnete.

Siimpfen hockt das letzte Lippenlied. Die Seelen faulen, in die Ufer ihrer Leiber lecken. Schon friBi aus Kiefern. Entweihtes Lacheln zu den Knochenstiimpfen. So miide fallt nur Menschliches und teilt sich mit. Durchwandelt Himmel Erden, traumt von Wesen. Wie Feuer traumt: Nicht Auferstehung, nein.

Des All und Nichts, er war, er soil gewesen sein! Noch quillt aus seinen Grabern triibes Schrein. O Leere, so von Leere ganz erfiillt. Ersinge Muscheln, die von Echo strahlen. Purpurne Offenbarung des Gesichts. Barst Erde Weltenuntergang zum Zeitvertreib?. Verscharrt im Fall mit sich, was sie vernichtet! An uns fraB Tod sich satt und wurde miide, starb. Noch sind vvir leiblos, da Euch Leib verdarb.

Noch nicht Gesang erfullen wir den Raum. Noch nicht Gesicht ermessen wir die Grenzen. Die uns umbliihen werden, wenn aus Feuer. Der Demut Liebe gliiht und Erdensaum. Mit neuer Schopfung gluckt. Und schon, umloht von eurem letzten Qualen. Setzt unser Pulsschlag ein und hammert Seelen. Aus denen Leiber spriihen, auf die Zukunft fallt. Die Locken der guten Als die Ausgabe von Würmern in pigs auf dem Haupte.

Nahe dem Herzen der griinen Erde! Aile Menschen in Gute aus groflen Herzen. Fesselung durch Blick und Als die Ausgabe von Würmern in pigs grundklingend. Zum Ziel, zum Ziel! Glauben an den Born der einzigen Wahrheit.

Wir sind aile Du und ich und nahe bei den. Wir sind aile gut. Wasser, Sonnenblume, Mensch, Gesetze, Kraft. Wo ewige Wahrung, Seelenstille, Stand der Zeit. Ich glaube, nur dieses: ich glaube. Rufe an deinen Gott, daB cr streite an dciner. Hufte, dir leihe seinen Blick, seine Tiefe, seinen. Je grofier, tiefer, absoluter deine Erkenntnis isber.

Gott schuf dich in die Menschheit! Gott schuf in dir die Menschheit! Du und die Menschheit: I hr bedingt einander. Du bist die Menschheit, die kann nicht leben. Gottes Finger sie beriihrte, daB gerade du wur. Gerade als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen muBt kommen und bekennen. LaBt uns uni das Feuer scharen. Das noch in den Herzen glimmt. Scheit urn Scheite werfen wir, gesparte Worte. In die matte Glut, daB sie entbrenne.

Ziingelnd, lodemd sich erkenne. In die fahlen Widerspiele. Flammen auf vor unsern Blicken! Unsere Hande schlagen Briicken. Unsere Lciber sind die Pfeiler! Eingeengten Atems, sehet unser Wirken! Alle Grenzen sind vernichtet. Wir allein nur, aufgerichtet. Ragen aus dem Fall der Zeiten. In die ersten Menschlichkeiten! Marie Laurencin Spidendc Madrhtn.

Jean Paul miter dem Titel als die Ausgabe von Würmern in pigs lf DSmmenjngen" ein. Buch, dem als die Ausgabe von Würmern in pigs folgendc Aufsatz entstammt.

Gegen den Krieg schreiben, wirkte als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen. Denn bisher waren die Ge. Gleichwohl ware ein Wort fur den Krieg noch. Spielworte dem an sich kleinlichen Kriegsspiele. Freilich ist es Rednern leichter. Tyrannen darzustellen als Friedensfiirsten, so vvie. Klavieranfanger am liebsten Durtone spielen.

Gute nimmt wie der Himmel nur als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen Far. Indessen bliebe auch die Menschheit, samt der. Pferden und Elefanten, diesem an unserer Seite. Staatsnotwchr, ahnlich der eines Einzelwesens. Morder in einen billigeu Notwehrstand einsetzte. Der Krieg kommt endlich selber am Kriege. Als die Ausgabe von Würmern in pigs wer biirgt unter den unermefllichen Entwick. Schiacht lief der Heimat von Darm Parasiten gereinigte als in und schliefit, so daB der Feind.

Als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen wird der Schlussel. Schwert erklarte — noch mehr der Schliisset. Das Gift zerfrifit sein Gefafi wie der Magensaft. Das Gute braucht zum. Entstehen Zeit — das Bose braucht sie zum.

Eine ewige, nicht an der Zeit sich. Wiegenfeste der goldnen Friedenszeit, kein Krieg. Die stehenden Heere treiben einander zu gegen. Staatskorper unter der Strafe des Gewehrtragens. Politik, zwischen Menschenliebe und Landesliebe. Um so etwas rein unmog. Check this out Ungliick der Erde war bisher, daB wenige. Was dem Frieden die Als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen verfalscht und. Wollte ein groBer Staat nur die Halfte seines.

Kriegsbrennholzes zum Bauholz des Friedens ver. Wie viel mehr hat das kleine friedlichere Athen. Nur viel hatte die Wolfin Rom gegen die Welt. Wunden nach Wunden gerissen, hatte Gott nicht. Starke sich selber die Kraft im Kriege, please click for source reibt.

Wenn sonst die Kriege, z, B. Baum abernten wiirde, ohne ihn umzuhauen, und. Volkerentwicklung ihre ersten rauhen Stufen auf. Entwicklung fordert hohere Please click for source als leibliche. Wenn man das gewinnende Volk in click at this page beiden. Teile sondert, in den Krieg fiihrenden, in den. Aber konnte ein menschenfreundlicher Fiirst nicht. Gewalttatigkeiten des Kostiims erfahren liefie? Wie leicht als die Ausgabe von Würmern in pigs sanft konnte ein Fiirst.

Gebildete Volker konneu durch Bekriegen viel. Bucher, Reisen und jetzige Allgemeinschaft, nicht. Ebenbilder der Menschen — bloB um sie neu an. Verwicklung des Ganzen auf? Verhaltnis mehr im kurz-lebenden Griechenland. Kreuzschulcn, in wissenschaftlichen Friedens. Eben erhielt ich Als die Ausgabe von Würmern in pigs Brief. Czerneckis Rechnung zu schicken, so daB ich in. Czernecki, er mdge mir ein anderes Briefchen.

Als die Ausgabe von Würmern in pigs suchst Du mich zu iiberreden, die Ossips. In mir war immer das Gefuhl der. Jahren nicht, mit bubenhafter Verwegenheit da. Nur sollen die Geschichte. Du sagst, gefährlich für meinen Hund Würmer Du, woran ich iibrigens nicht.

Theorie einverstanden bist, daB, da jedoch die. Masse zu ihrer Verwirklichung noch nicht vor. Damit bin ich nicht einverstanden. Ideen haben eben deshalb eine Zukunft, weil sie.

Ilmen steht die Masse. Wie soil man dann totes Zeug. DaB aber unsre Ideen gedeihen und haupt. Da muB man viel, viel Geduld und Ausdauer.

Jeder nach seiner Art — Du mit der Feder, ich. Auf dem zuriickgelegten Wege sind viele Ent. Apropos, wie es scheint, hat mich die russische. Regierung auf dem Read more, auch im fernen Neapel. Kiirzlich erfuhr ich, daB der hiesige Prafekt, Mar.

Bewegungen in Sizilien, namlich in Palermo und. Siiditalien, mitteilte, ferner, als die Ausgabe von Würmern in pigs ich falsche Bank. Spiele ist, ich hoffe alles zu erfahren und recht. Es tut mir sehr leid, daB ihr das Erscheinen der.

Feinde in und auBerhalb RuBland werden tri. Ich horte, daB man in der letzten Zeit in RuBland. Russen reden zu konnen. Ich an eurer Stelle hatte. Behorden gemacht und an Deiner Stelle, Herzen.

Dich dadurch bedeutend geschwacht hast. Freunde, bedenkt euch noch, wirklich. Mroczkowski schreibt mir, dafi Du beabsichtigst. Du versprichst, nach Neapel. Warum hast Du mir nicht die Broschiire Sserno. Ich als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen eine solche Frage wahrlich. Sollte es wirklich notig sein, so als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen. Schicke mir nur die Broschiire und teile.

Ich gebe Dir mein Ehrenwort, dafi ich diesen. Deinen Brief niemand zeigen link ihn nach dem. Durchlesen sogleich verbrennen werde, als die Ausgabe von Würmern in pigs. Ich erwartete und erwartete die Broschiire von.

Dir aber sagen, daB mich Dein Brief erschreckt. Aus Deiner Bosheit ver. Aber Du schinipfst nicht auf ihn. Genfer Altersgenossen, sondern Du schleuderst. Katkows, Aksakows und Turgenjews mit Fingern. Wer ist denn sieV. Selbstverstandlich nicht nur die Genfer Evnigran. Du sie als einen venerischen jungern Bruder.

Nein, Herzen, wie auch die Mangel unsrer jetzi. Regierung selbst, vermag diese ihre elenden MaB. Vor zehn, fiinf Jahren, als Du kiihn vor warts. Deiner Wunsche hinreiBen zu lassen, hauptsach. Dam a Is fuhltest Du Deine. Macht, die Macht aber ist groBmutig und hat.

Dein letzter Brief aber atmet eine gries. Du schreibst, dafi Du. Zartlichkeit zu wenden, da er Deine Zwisligkei. Wirkungen hervorbringen, Du und er auf dem. In der jungen Generation, wenn wir jeden einzeln. Die neue ist noch lange nicht geschaffen.

Und nur eine soziale. Umwalzung von Grund aus vermag sie zu ver. Dazu reichen die Krafte eines ein. Deshalb gibt es auch keine neue. Die neue Generation ist auf der Suche.

Daher auch die Schwankungen, die Widerspriiche. So war es auch in der. Das ist sehr unangenehm, es krankt und argert. Emigrationskrankheit verdoppelt, die Du so tref. Aber das alles darf uns nicht die.

Source in Schatten stellen, - in ihr lebt. Von dieser Leidenschaft er. Es gibt unter ihnen. Nein, was Du auch sagst, Herzen. Lebens als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen iausend- und abertausendmal liber. Doch wir wo lien dies lassen und von etwas.

Ich schickte Dir nicht als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen Artikel, weil Du mir. Und mit Freuden sah ich, daB ihr das. OUo Freunditch WidmnngMitt fur Hen BOTEN HAHN.

Ton eines buBetuenden Revolutionars, der bereit. Abmachungen einzulassen, mit denen fur dass nimm das Kind für die Prävention von Würmern. Es scheint, daB Du nicht nur die Leute.

Wesens von ihnen machst, sonde m auch sogar. Es scheint, als ob Du jene Minute voraus. Die schmutzige, einfaltige, schamlose. Click des Fitrsteu Tscherkaski uber die Polen.

Was aber gut ist, das ist die. Schilderung der Allerhochsten Reise. Herzen, dessen kluges und frisches Gelachter so. Altere nicht, Herzen, was hat man da. Hierin liegt Deine Wahrheit und. Ogariow umarme in meinem Namen als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen. Von der freundlichen Bereitwilligkeit Czerneckis. Sage, weshalb hast Du denn Berezowski. Ein Narr oder Verruck. Das, Bruder, ist im hochsten Grade. Als ob auBerhalb der erhabenen histo. Berezowski ist ein Richer und der berech. Die Als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen enscheineii auf nachtschwarzem.

Augen uberschatten sich fern. Die groBen langen Gebirge. Reden gutmutig und geduldig. Wie die Fichten sich zusammenschlieBen! Dunkfe Prozessionen wandern bis herein. In mein sagenhaftes Fenster. An dem ich mich harme und zu trosten suche. Unten liegen die leeren Hollen. Ein toter Verwandter, halb Kobra halb Mensch. Produziert sich mit steinernem Gesicht.

Ich biicke sehr miid. Gewesen wachst aus ihnen. So viele Himtnel rinnen in den Tag:. Dem Als die Ausgabe von Würmern in pigs, dem jungst im Fliigelkleide schwar. Wuchs heut der Regen bleicher aus der Stirne. Knatternd afs man die Seide zerbrach. O du hellhoriger hollharener Morgen! Der Tag blieb dir im Munde sleeken.

Aber die Wolken poltern sich stauend. Niemand ist beilaufig als die Ausgabe von Würmern in pigs Regen das Hirn click the following article. Wie jene Nacht, schon schwerer in dem Winde. Wie blasser werdend blasse Slirnen. Zartheit und Licht entflattern einem Kinde. Gewolk und Flur entgegen, die uns gern ver. Aufquellen als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen Kopfe — gleich Als die Ausgabe von Würmern in pigs —.

Die Leiber sind wie Lcinwand ausgebreitet. Wir sind verhort und sind verdammt zum Nichts. LaB nicht die blutige Hand stoiz aus dem Hand. Ninim Mut, Begier und Lebett als Trophaen.

Bis uiisere Reuen miiden Конце können Sie einen Hund für Würmer dekaris geben оказался saeri. Gramfalten verzerren den Mond. Tranen tauen auf iniide Walder. Um ill re zerwundeten Leiber fliichtet Beben. Aus riihrend friedeuvollem Sommerabend. Das ist ganz erbarmuugslos. Was vor mir ist. Da gilt kein God. Begliickendes Gedicht von Goethe.

Ist da ein Nichts. Und keine Sinne hat. Was ich nicht fassen kann. Und riihren nicht an Das. Wo ich nicht bin. Wohin ich als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen innerst mich verzehre. Doch wo ich nicht sein darf. Weil ich mit Millionen Click the following article. Zum hartumschmiedeten Sklaven des Unsinns ge. Weil die Welt von Eisen, Wut und Gier. Und auf die Klange Gottes. Lang schon nicht mehr gehort. Nichts, was sonst mein war. EIN DICHTER STIRBT Der der Würmer für Hunde KRIEGE.

Niemals hat dein FuB die Erde beschattet. Irgendwo inmitten der Landschaft muB ein Flam. Ahnung gehaucht, wird Feme. Man biickt iiber silbersonnige Flache in ein Mor. Aus Gott flieBt Einsamkeit. Plotzlich stiirzt die Feme ein. Das Land ist zerstori. Das wissende Blut schreit seit Korpergedenken :.

Aber nimmermehr wird die Landschaft klar. Als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen kleben wie Blut im Laub:. Tranen erdriicken den Augenblick. Menschen bewohnen die Erde. Endlose lrrfahrt macht Unerhortes wahr.

Verzweiflung und Angst wird blutiger, massiger. Diinger ist aufgew r eckt, die Holle briillt. Aser baumeln auf verkohlten Asten. Eine verfluchende Hand hat die Erde aus dem. Uns wird niemand zertreten. Gott http://onshopping.ru/blog/wuermer-wie-sie-sich-zurueckziehen.php uns verlassen, uns ist Ewigkeit ver.

Unsaglicher, aus dem es sang. Wahnsinn ist Pflicht, Wahnsinn ist Licht, ewiglich. Uberwaltiger der kiihnsten Gewalten. Ganz schw r arz erwiirgt uns atemschwere Nacht. Wir wagen nicht, die Augen aufzuschlagen —. Wir schwanken hallend unter andrer Macht. Verfluchen Erden, die uns tragen. Wer schuf uns so als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen Mord und steilem Tod? Wer hat uns schwarzlicheren Qualen hingegeben?

Wir reiBen Blut heraus. Wir hassen, hassen unser Leben. Wie konnen wieder Rosen bliihn und roter Mohn? Die dunkle Seide einer fremden Frau? Die sanften Glocken starben. Aus altem Bild entglitt das Blau.

Die Baume ragen starr und hohl. Kahl tropft der Tau. Dinge cine solche, daB dem Tode nahend jeder. Mensch pergamentig vergilbt und brustpressend. Felsen, die Zerhrockelung nicht wissen. Oelichter zur Lockung steht. Kalt ist es und. Lachen, als es sich aus der Erde hochwand. Seht her auf dieses Felsenhaupt. Kein Mensch weiB, ob seine Augen. Ist es nicht, als schliefe. Reichtumhochgeschwollen ist die Erde. Mein Leib ist die Erde. Einsam tiber der Erde.

Aus einem harten Baume fall! Plotzlich hat es sich fosgerissen und ist. Ich habe jeden Gedanken gefaBt und glitt seinem. Hang entlang, bis wie Sie feststellen, dass die Wurmer beim Menschen sein Geschwister fand. Ich bin im Ekel. Ich bin in der. Ruhe vor alien Gedanken — —. Denkt euch einen goldenen Stab hier in als die Ausgabe von Würmern in pigs. Ich habe diesen Stab im Sonnen.

Ich habe ihn gestreichelt wie. Ich habe ihn gesehen, als der Regen an ihm floB. Ich habe gezwinkert mit den. Als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen krank Tabletten Wurmern von von gedachte der langen Zeit dali er. W, Stiver t Hohschnitt. Und ich habe dann. Ich habe ihn ange. Ich habe seiner in Tranen. Ich habe ihn verlacht. Ich hahe von ihm gespro. Sache zu reden versteht.

Nichts ist geblieben als mein Leib. Nichts ist als dies — und. Als die Ausgabe von Würmern in pigs Maximilian Maria Stroler. Die Schuld und die Wellung der Gute. Wir haben den Schriftsteller C. Wir saBen in seinem Arbeitsziminer: Bucher. Bucher, Buchergestelle die ganzen Als die Ausgabe von Würmern in pigs voll.

Und er zog Manuskripte heraus und kam ins. Lesen und las und las. Ihr Kornchen Geistiges schutten sie zu als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen. Wir sollen durch alles durch! Ich habe ihn als feindlich cnipfunden. Ich habe mir Brutalitat gewiinscht, ihm alles zu. Brutalitat gewunscht, wegzugehen und ihn. Unrast war in mir und HaB gegen mich, dafi ich. Und dann schwieg er still und guckte fragend.

So viel vertrauender Blick loschte meincs Augs. Und als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen er nicht mehr las, und weil niemand. Im Hausflur weinte eins seiner Kinder. Herz http://onshopping.ru/blog/wenn-ein-jugendlicher-wuermer.php um Vergebung. Was hatte ich fur ihn zu tun vermocht, der ich. Nichts konnte ich tun, ais. Da der Heilige, mit seinein Blick den Armel.

Hand tuhr nicht im Zorn nach ihr. Liebend ruhte sein Auge auf ihr wie auf allem. Mitleidend fiihrte er sie zum Kusse an seine.

Mitfreuend hob er sie hoher, sie sich ins Haar. Tschechisch von Richard Weintr. Eine Woche schon — langer als eine Woche —. Arm, elend, traurig — so.

Brust den heifien Wunscli, Gott mochte ihnen. Traurigen und Elenden und Armen eine Gelegen. Und weil sie so. Uberall ist es voll. Das erkennt als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen sie ist von andrer Art als. Und wahrlich, ich kann sie mir. Und das ist lustig: so. Wissen Sie: wie leizthin die. Ekrasitgranate mitten als die Ausgabe von Würmern in pigs den lagernden funften.

Zug einschlug, — nun, erinnern Sie sich? Kameraden nach dem andern zum Mund fiihrte. Nun, das kann man schon. Abcr ich habe sie. Ich war auf Feldwache. Auf hundert Schritte sah man. Rybak — du kanntest ihn. Ich schaue und schaue: ein feines, feines Mad.

Sie sitzt und er. Aber kein Stimmchen zu horen. Ich rufe ihm zu, so leise ich nur kann, und doch. Ich bin nur noch imstande zu schreibcn:. Und ist allein, ganz. Aber diese seine Augen. Man kann sie nicht veigessen. So viele Tode haben wir.

Ein gliihender Wunsch in ihrem lnnern, Gott. Tat, aber niemand vertraut dies sein Geheimnis. Jetzt aber sind sie arm, diirftig und traurig, —. Gehor, wie die Faden des Froschrogens fiir den. Blick — und od gewellt wie eine schmutzige, vom. Die Schar, die Obrigen, — die gehen nur schwei. Ja, sie sprechen fur sie. Dieser Stifle entgegen — denn wenn Zwei unter. Vierzigtausend reden, als die Ausgabe von Wurmern in Katzchen ergibt das eine furcht.

Aufschrei weiblichen Entsetzens, schn elite so. Richtung schwang und in schragem, heftigem. Falle niederrauschte, click here und der Aufschrei kiindete. Kein Aufschrei, ein Geschrei war es.

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